부화 직후부터 변태를 완료하는 58일째까지 찰가자미 자어에서 소화효소들의 활성과 성장이 조사되었다. 자어들은 먹이를 공급하지 않는 조건과 충분히 공급하는 두 가지 조건에서 사육되었고 일정한 간격으로 성장과 함께 acid phosphatase(ACPase), alkaline phosphatase (ALPase)의 비활성 및 trypsin-like enzyme과 pepsin-like enzyme의 활성 변화를 파악하였다. 절식구에서 전장의 성장은 부화 후 7일까지 빠르게 증가하였으나, 이후부터는 거의 변화가 없었고 먹이 공급구의 경우 부화시 5.13$\pm$0.18mm였던 것이 58일 후 13.43$\pm$1.40mm로 성장하였다. 절식구의 개체 당 건조 체중은 부화 직후부터 기아로 사망이 발생한 12일째까지 시간이 경과할수록 감소하였다. 먹이 공급구의 경우 난황이 흡수될 때까지는 감소하였지만, 부화 후 20일째부터 빠르게 증가하기 시작하였다. ACPase와 ALPase 비활성은 절식구의 경우 실험을 종료할 때까지 증가하였으나, 먹이공급구는 부화 후 20일까지 증가한 후 실험을 마칠 때까지 서서히 감소하였으며 두 실험구 사이에서는 유의적인 차이가 없었다. 절식구의 trypsin-like enzyme 활성은 부화 후 3일부터 증가하여 6일째에 가장 높은 활성을 나타내었으나 난황을 완전히 흡수한 이후부터는 활성이 거의 검출되지 않았다. 먹이 공급구의 경우 부화 후 3일부터 난황을 완전히 흡수할 때까지 빠르게 증가하였고,20일째 가장 높은 활성을 나타내었다. Trypsin-like enzyme 활성은 부화 후 8일부터 먹이공급구가 절식구보다 유의적으로 높게 나타났다. Pepsin-like enzyme 활성은 두 실험구 모두에서 부화 초기에는 증가하였으나, 절식구에서는 실험종료 시까지 감소하였고, 먹이 공급구는 부화 후 10일째 높은 활성을 나타낸 후 일시적으로 감소하지만 부화 후 20일째 다시 높은 활성을 나타낸 후 실험 종료 시까지 서서히 감소하였다. Pepsin-like enzyme 활성은 8일째와 10일째 절식구가 먹이공급구보다 유의적으로 높게 나타났다. 이상의 결과들을 종합해보면 ACPase, ALPase의 비활성 및 trypsin-like enzyme과 pepsin-like enzyme치 활성은 자어의 성장이나 형태 발달과 깊은 연관이 있었다. 그리고 trypsin-like enzyme과 pepsin-like enzyme의 활성은 자어의 발달 단계, 성장 및 먹이 공급 등에 영향을 받기 때문에 자어의 건강이나 성장 상태를 나타낼 수 있는 간접적인 지표로써 이용 할 수 있겠다.
말쥐치 자치어의 성장에 따른 소화기관 및 trypsin, pepsine-like enzyme, lipase, amylase 활성의 변화를 확인하기 위하여 64일간 사육실험을 수행하였다. 자어는 부화 후 2~26일 rotifer Brachionus plicatilis를 급이 하였고 부화 후 10~64일에는 Artemia nauplii를 급이 하였다. 그리고 부화 후 40일부터 배합사료를 급이 하기 시작하여 사료를 서서히 전환하였다. 사육기간 동안 수온은 $21.5{\sim}24.2^{\circ}C$를 유지하였다. Trypsin과 Lipase 활성은 부화 후 4일째($6.0{\pm}1.4unit$) 그리고 6일째($4.5{\pm}1.4unit$) 각각 확인되었다. 이들 두 효소의 활성은 말쥐치 자어후기와 치어초기에 급격히 증가하는 경향을 나타내었다. Pepsin-like enzyme 활성은 부화 후 10일째 확인되었고 말쥐치 치어 초기 단계인 28일부터 급격히 증가하였다. Pepsin-like enzyme 활성 변화와 위선 수의 변화가 일치하는 것은 흥미로운 현상이라고 할 수 있다. Amylase 활성은 부화 후 10일째 확인되었고 부화 후 28일까지 낮은 값을 유지하였으며 부화 후 28일과 40일 사이에 급격히 증가하였다. 결과적으로 말쥐치 치어초기의 Trypsin과 Pepsin-like enzyme 활성의 급격한 증가와 위선 수의 증가에 기인하여 치어기 급격한 체성장이 일어났을 것으로 사료된다.
본 실험은 볼락 종묘를 안정적으로 대량 생산하는 데 필 수적인 자치어기의 성장과 소화효소인 trypsin, pepsin-like enzyme, amylase 그리고 lipase의 activity를 측정하여 소화생리에 대한 기초 자료를 제공하고자 수행하였다. 산출 직후 자어의 체장은 $5.01{\pm}0.22 mm$이었던 것이 산출 후 100일에는 $36.01{\pm}1.22 mm$ 까지 성장하였고, 습중량은 산출 후 70일 전후로 급격히 증가하였다. trysin 활성은 산출후 2일째 처음으로 확인되어 $7.00{\pm}1.48$ unit을 나타내고 산출후 66일 $1425{\pm}230$ unit으로 peak를 나타내었다. pepsin-like enzyme 활성은 산출 후 11일째 처음으로 확인되었고 산출후 66일째 $902{\pm}160$ unit까지 급격히 증가하였다. Lipase 활성은 산출후 2일째 $4.5{\pm}1.4$ unit으로 확인되었고 산출후 47일계에는 $38.3{\pm}0.4$unit로 peak를 나타내었다. Amylase 활성은 산출후 11일째 $0.18{\pm}0.11$ unit으로 처음 확인되었고 산출후 50일째 $23.48{\pm}5.11$ unit까지 급격히 증가하였다. specific activity는 trypsin이 산출후 14일째, pepsin-like enzyme이 61일째 peak를 나타냈다. 볼락의 체중이 현저하게 증가하는 시기에 맞춰서 각 효소와 전활성이 급격히 상승하는 것을 확인 할 수 있었다. 이것은 이시기가 위선이 기능적으로 역할을 하는 시기와 일치하므로 단백질 소화능력의 비약적인 증가가 체중 증가에 크게 관여하였음을 나타낸다. 그러므로 본 실험에서 확인 된 체중이 급격히 증가하는 시기는 볼락 양식에 있어서 사료 전환기 즉, 생물사료에서 배합사료로 전환하기에 적당하다고 할 수 있겠다.
두유박 단백질을 시료로 하여 pepsin을 사용한 가수분해와 plastein 합성의 최적조건을 조사하였다. 가수분해의 최적 기질농도는 3%이었으며, 기질에 대한 최적의 효소 농도는 2%이었고, 최적 pH, 반응온도 및 반응시간은 각각 pH 1.7, $45^{\circ}C$ 및 24시간이었다. Plastein 합성 조건으로 기질농도 40%, pH 4.0, 반응온도 $45^{\circ}C$, 반응시간 18시간, (효소/기질) 농도 1%를 설정하였다. 생성된 plastein은 반응시간 및 기질농도 별로 전기영동으로 확인하였다.
Distribution of the proteolytic activities of crude pretense extracted from the viscera of ten kinds of fish was examined. Their proteolytic activities on proteinous substrates (azocasein, hemoglobin, and casein) from the viscera of anchovy, bastard flatfish, mackerel and red sea bream were higher than those of other fishes, and the crude pretenses were further fractoinated with acetone or ammonium sulfate. Optimum concentrations for pretenses fractionation were $0\~55\%$ for acetone and $30\~70\%$ for ammonium sulfate. The fractionated viscera pretense of mackerel showed the highest proteolytic activity among four kinds of fishes. Activities of cathepsin D- and pepsin-like enzymes at pH 3.0, cathepsin L-, B-, H- and G-like enzyme at pH 6,0, and Hypsin- and chymotrypsin- like enzymes (pH 8.0) were detected in the fractionated viscera pretense, whereas activities of cathepsin L- and chymoeypsin-like enzyme were observed in commercial pretenses. Proteolytic activities of Alcalase, Protamex, and Aroase AP-10 for azocasein were slightly higher than the fractionated viscera pretenses, but their amidolytic activities at pH 6.0 and 8.0 toward synthetic substrates were lower than counterpart. The fractionated pretenses from fish viscera would be utilized as commercial pretenses.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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