독화된 진주담치 (blue mussel, Mylilus edulis)를 pH 처리, 온도별 저장 그리고 가열에 의한 마비성 패류독의 독성과 독조성 특성 변화는 다음과 같다. pH 3으로 조절한 시료가 14.1 MU/g$(100\%)$으로 가장 높은 독성이 검출되었고, pH 5는 12.9 MU/g$(92.1\%)$, pH 7은 9.0 MU/g$(63.8\%)$으로 검출되었으나, 마비성 패류독은 독성이 불안정한 알칼리 조건인 pH 9에서는 3.6 Mu/g$(25.5\%)$, pH 10은 0.8 Mu/g$(5.7\%)$으로 독성 이 검출되었다. 저장기간 동안의 독성은 pH(3, 5, 7, 9) 그리고 온도(30, -5, $20^{\circ}C$)에서 5일$(19.9\~65.3\%)$까지 현저하게 감소하였으나, 5일 후부터 30일까지는 약간의 독성이 감소하였다. 그리고 더 높은 온도에서 저장에서는 독성이 더 빨리 감소하였다. 대부분의 성분인 C군(C1, C2)과 GTX1,2,3,4, STX 그리고 dcSTX으로 8개의 성분이 검출되었고, 8개의 독성분 중에서 GTX1,4, STX 그리고 dcSTX는 모든 가공 조건에서 독성이 감소함에 따라 제일 먼저 감소하였다. 독성이 기준 독성치(4 MU/g)보다 3배 이상이더라도 마쇄된 패류 육에 pH를 알칼리 (pH 7이상)로 처리하고, 10분의 가열에 의해 독성을 완전히 제거할 수 있었다.
본 연구는 2012년부터 2016년까지 전남 가막만해역에서 생산되는 패류에 대하여 위생지표세균, 마비성 및 설사성패류독소를 분석하여 세균학적, 독물학적 안전성을 평가하고자 하였다. 총 194점의 굴 시료에서 분변계대장균과 대장균을 분석한 결과 모두 230 MPN/100 g을 초과하지 않았다. 굴 수확시기 동안 분석한 분변계대장균의 기하학적 평균치는 19.6 MPN/100 g으로 비수확시기(26.5 MPN/100 g) 보다 안정적인 것으로 나타났다. 가막만해역의 독물학적 평가를 위해 굴 77개 시료와 패류독소 지표종인 지중해담치 350개 시료에 대한 분석을 실시하였다. 마비성패류독소는 4월말부터 6월초 사이에 지중해담치 13개 시료에서 $40{\sim}46{\mu}g$/100 g 범위로 매우 낮게 검출되었으며, 굴 시료에서는 전혀 검출되지 않았다. 설사성패류독소는 총 180개 시료 중 2개 시료에서 검출되었으나, 기준치에 미치지 못하는 것으로 확인되었다. 따라서 가막만해역에서 생산되는 패류의 세균학적 안전성을 평가한 결과, 식품위생법의 패류 위생기준에 적합하였고, EU의 패류생산해역 A등급 기준에 부합하는 것으로 확인되었다. 또한 마비성 및 설사성패류독소는 기준치보다 매우 낮은 수준으로 검출되어 독물학적 안전성이 확보된 패류생산해역으로 평가되었다.
Lee, Ka Jeong;Ha, Kwang Soo;Jung, Yeoun Joong;Mok, Jong Soo;Son, Kwang Tae;Lee, Hee Chung;Kim, Ji Hoe
Fisheries and Aquatic Sciences
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제24권11호
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pp.360-369
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2021
Paralytic shellfish toxins (PSTs) and tetrodotoxin (TTX) are neurotoxins that display pharmacological activity that is similar to that of specific sodium channel blockers; they are the principle toxins involved in shellfish and puffer fish poisoning. In Korea, puffer fish is a very popular seafood, and several cases of accidental poisoning by TTX have been reported. Therefore, it is necessary to determine whether puffer fish poisoning incidents are caused by PSTs or by TTX. In this study, we used mouse bioassay (MBA) and liquid chromatograph-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to determine the presence of PSTs and TTX in puffer fish from an area near Mireuk-do, Tong-Yeong on the southern coast of Korea from January through March, 2014. The toxicity of PSTs and TTX extracts prepared from three organs of each specimen was analyzed by MBA. Most of the extracts killed mice with typical signs of TTX and PSTs. The LC-MS/MS analysis of seven specimens of Takifugu pardalis and Takifugu niphobles, each divided into muscles, intestines, and liver, were examined for TTX. In T. pardalis, the TTX levels were within the range of 1.3-1.6 ㎍/g in the muscles, 18.8-49.8 ㎍/g in the intestines, and 23.3-96.8 ㎍/g in the liver. In T. niphobles, the TTX levels were within the range of 2.0-4.5 ㎍/g in the muscles, 23.9-71.5 ㎍/g in the intestines, and 28.1-114.8 ㎍/g in the liver. Additionally, the toxicity profile of the detected PSTs revealed that dcGTX3 was the major component in T. pardalis and T. niphobles. When PSTs were calculated as saxitoxin equivalents the levels were all less than 0.5 ㎍/g, which is below the permitted maximum standard of 0.8 ㎍/g. These findings indicate that the toxicity of T. pardalis and T. niphobles from the southern coast of Korea is due mainly to TTX and that PSTs do not exert an effect.
해수에서 분리한 마비성패류독 분해 균주 Enterobactersp. CW-6 균주의 마비성 패류독소 최적 분해 온도 및 시험 균주의 독소 분해과정 중의 독소 함량 및 구성성분을 조사한 결과는 다음과 같다. 시험 균주는 배양 적온으로 확인된 $30, 35^{\circ}C$에서 배양 5일만에 각각 최초 첨가 독력의 $56.8, 44.1{\%}$, 12일 후에는 $93.0, 79.5{\%}$를 분해하였다. 그러나, 배양 적온에서 벗어날수록 균주의 독소 분해 활성은 감소하여 $20^{\circ}C$에서는 배양 12일 후에도 최초 독력의 $69.0{\%}$가 잔존하였다. 시험 균주 Enterobacter sp. CW-6는 $30^{\circ}C$에서의 조독소를 이용한 분해 활성 측정에서 초기 농도 38.2nmole/g의 마비성패류독을 배양 8일 및 12일째 각각 $88.4, 92.7{\%}$ 분해하였다. 정제 독소를 이용한 분해 시험에서, 조독소 분해과정 중에 일시적으로 증가하는 STX group은 GTX2, 3에서 전환된 것으로 확인되었다. 시험 균주 Enterobactersp. CW-6는 정제 독소에 대해서도 강한 분해 활성을 나타내었으며, 최초 농도 47 nmole/g 의 GTX1과 37 nmole/g GTX4를 분해 과정 12일 후에 각각 $100, 90.8{\%}$ 분해하였으며, GTX2, 3 혼합물에 대하여는 최초농도 25.6 nmole/g의 독소를 12일 후에 $66.4{\%}$까지 분해하였다.
1988년 4월 경남 거제군 하청면의 양식장(養殖場)에서 약하게 독화(毒化)한 진주담치 Mytilus edulis galloprovincialis(4MU */g 가식부)를 채집하여 마비성패독(痲痺性貝毒)의 조성(組成)을 조사(調査)하기 위하여 고속 액체 크호마토그라피(HPLC)법으로 분석(分析)하였다. 독화된 진주담치의 중장선을 산추출하여 탈지, 활성탄처리 및 Bio Gel P-2 겔 여과 크로마로그라피법으로 부분정제(部分精製)하여 HPLC로 분석(分析)한 결과(結果), 진주담치독(毒)은 gonyautoxin 1-4(GTX 1-4)를 주성분(主成分)으로 하고, saxitoxin(STX)과 protogonyautoxin 1-2(PX 1-2)가 미량 함유되어 있음을 확인하였다.
동물시험법과 동일한 시료 전처리법을 이용하고 HPLC의 높은 감도와 선택성을 극대화하여 독소성분의 그룹분석이 가능한 PCOX법을 우리나라 패류시료의 매트릭스 특성에 맞도록 최적화하였다. 이 분석법은 GTXs/STXs와 C toxins의 그룹별 동시 분석과 독소성분의 분리와 정량이 가능하였다. 회수율은 83.5% 이상이며 반복시험에서 나타난 표준편차는 7% 이하로 AOAC international의 기준에 부합되었다. 총 독소에 대한 정량한계는 최고 $8.6{\mu}g$/100 g 수준으로 동물시험법에 비하여 약 4.6배 이상의 향상된 분석능력을 가진 것으로 확인되었다. 또한 AOAC guidelines에 근거한 시험소 내 시험법 유효성 검증결과 모든 항목에서 적합한 결과가 도출되었다. 동물시험법과의 동등성 비교에서는 굴과 진주담치 매트릭스에 대한 두 시험법은 상관계수가 각각 0.9534와 0.9109로 매우 좋은 상관관계를 나타내었다. 한편 분석에 사용된 column ($C_{18}$ 및 $C_8$)의 특성차에 의한 시험결과의 영향 정도를 파악하기 위해 시판 column 7종에 대하여 평가를 실시한 결과, 동일 계열의 column을 사용하더라도 column의 물리화학적 특성과 수지와 반응기의 결합특성과 수지 봉쇄특성에 따라 분리도와 분석시간에 영향을 받는 것으로 나타나 column 적용 가능범위는 다소 좁은 것으로 확인되었다. 동물시험법에 비하여 PCOX 법은 단백질 제거, 크로마토그래피 현상을 이용한 독소성분의 분리, 독소성분 산화를 통한 형광성 퓨린의 형성과 특이적 파장을 이용한 형광검출과 같은 단계를 가지고 있어 특이성이 더 높았다. PCOX 법은 이러한 시험원리에 기인한 특이성과 더불어 동물시험법에서 방해물질로 작용하는 carbamate와 같은 신경독소와 유기인계 살충제에 영향을 받지 않는 점과 blank 시료에 대한 false positive 결과를 배제할 수 있는 점에서 기인한 특이성을 동시에 가지고 있다. 또한 국제적으로 제기되고 있는 실험동물 사용억제 노력에 부응할 수 있는 윤리적 측면의 이점뿐만 아니라 동물시험법으로는 알아낼 수 없는 시료 중 마비성 패류독소 성분을 밝힐 수 있는 과학적 측면의 이점도 가지고 있다. 독소성분 분석을 통해 마비성 패류독소 원인 플랑크톤과 패류 중 독소성분을 비교하고 패종 별 독소축적 양상을 파악할 수 있어 마비성 패류독소 위해관리 대책수립에 필요한 정보를 제공할 수 있다. 한편, HPLC 기반 분석법의 사용확대를 위해서는 관련 표준독소의 상업적 생산과 유통이라는 제한점을 극복해야 한다. 최근 캐나다 NRCC와 일부 관련기관에서 독소성분별 표준품을 시판하고 있으나, 지속적인 독소성분의 동정과 표준물질의 개발에 관련 연구자의 지속적인 관심과 노력이 필요하다.
1989년 및 1990년도 진해만산 진주담치(Mytilus edulis)와 1989년도산 유독와편모조(Alexandrium tamareme) 배양 조체의 마비성패독 성분의 조성과 독성을 mouse assay법과 post column을 이용한 형광고속액체 chromatography법으로 조사하였다. mouse assay법으로 조사한 진주담치의 독성은 1989년산(3-4월)이 중장선 1g당 31-88 MU, 1990년도산이가식부 1g당 1.9-9.9 MU이었다. 독조성은 1989년도산의 경우, gonyautoxin1-4$(48-76\%), C1-C2\;(14-39\%),$ saxitoxin$(1-10\%)$, neosaxitoxin$(l-7\%)$ 그리고 미량의 decarbamoyl gonyautoxin 2,3가 포함되어 있었으며, 1990년도의 경우는 neosaxitoxin의 함량이 $44-50\%$의 비율을 나타내어 년도에 따라 큰 독조성의 차이를 나타내었다. 한편,A. tamarense의 배양조체의 독조성은 1989년도산 진주담치 와 유사하였으나, Cl, C2, decarbamoyl gonyautoxin 2,3의 비율이 다소 높았다.
1985년 5월부터 1987년 10월에 걸쳐 한국산 주요패류인 진주담치, 굴, 피조개 등 13종류 506개 시료를 대상으로 마비성패류독의 시료별, 지역별, 및 수심별 분포를 밝히고 아울러 독소함량과 독소생성 원인플랑크톤 중의 하나인 Protogonyaulax tamarensis와의 관계에 대하여 실험한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 총 506개 시료 중 53개 시료에서 PSP가 검출 되어 약 $10.5\%$의 검출율을 나타내었으며 PSP가 검출된 시료는 진주담치, 피조개, 바지락과 키조개등 4종류 뿐이었고 나머지 시료에서는 검출되지 않았으며 이 중 PSP가 가장 빈번하게 검출된 시료는 진주담치이었다. 2. PSP가 곁출되는 시기는 주로 2-5월이었으며 특히 3월과 4월에 검출율이 높아 총양성시료의 약 $52\%$를 점하였다. 지역별로는 남해안지역에서 고루 검출되었으나 부산지역의 경우 6월과 7월에도 진주 담치에서 PSP가 검출되어 지역차를 나타내었다. 3. PSP가 검출된 53개 시료의 독소함량은 진주담치가 피조개, 바지락에 비하여 다소 높았으며 지역별로는 마산지역이 가장 높았고, 독소 함량이 가식부 100g당 $800{\mu}g$을 초과하는 시료는 전체의 $2.6\%$에 불과하였다. 4. 마산지역에시 PSP의 함량과 P.tamarensis의 수 사이에는 일정한 상관관계가 나타나지는 않았다. 5. 패류서식 수심별 패류독화을 및 독소함량은 표층이 다소 높게 나타났으나 큰 차이는 없었다. 6. 독화된 진주담치의 중장선에는 전체독소함량의 약 $70\%$가 함유되어 있었으며 g당 독성은 중장선이 나머지 육질부에 비하여 약 9배나 높았다.otease로 추정되었다. 100V에서 80V로 강압하므로서 집어등을 2m 높이에서 4m 높이로 이동시키지 않더라도 같은 집어효과를 얻을 수 있다.> 단독 그리고, lysozyme$(0.05\%)$ + sodium pyrophosphate $(0.5\%)$ + sodium hexametaphosphate$(0.1\%)$ 용액에 5분간 침지 처리하였을 때 약간의 방부효과는 인정되었으나 sorbic acid$(0.2\%)$을 첨가한 것보다 효과가 적었다.나타내었다., MW=0.4913 TW-0.1228 (r=0.9809)이었다.로 함량은 각각 902.2 mg/100 g, 28.3 mg/100g 및 8.6mg/100g이었다. 이외에 malic acid 등 6종의 유기산이 미량 함유되어 있었다. 제품의 유리아미노산 및 관련화합물의 조성은 histidine이 641.8 mg/100g으로 가장 많았고, alanine 214.7 mg/100g, hydroxyproline이 48.9mg/100g, 이외에 lysine, glutamic acid 및 anserine 등이 전체의 $80.8\%$를 차지하였다. 고등어분말수우프의 맛성분은 건물량 기준으로 유리아미노산 및 관련화합물이 1,279.4 mg/100g, 불휘발성유기산이 948.1mg/100g, 핵산 관련물질 672.8 mg/100g, 총 creatinine이 430.4 mg/100g, betaine 86.6mg/100g 및 미량의 TMAO로 이루어져 있었고 국물로 우려낼때 맛성분의 추출조건은 $100^{\circ}C$에서 1분간의 고온단시간 추출이 적합하였다. 증가를 나타내었는데, 저장기간에
마비성 패류 독소(Paralytic shellfish poisoning, PSP)는 유해 조류에 의해 생성되며, 독소에 노출된 수산물을 섭취하였을 때 중독이 발생한다. 수산물 중 PSP를 검출하는 표준 시험법인 Mouse bioassay (MBA)는 낮은 검출한계와 동물 윤리 문제로 대체 시험법의 개발 필요성이 대두되고 있다. 이러한 대체 시험법 중, PSP가 신경 세포막의 Na+ 채널을 차단하는 기전을 이용한 마우스 뇌신경 모세포종 세포 기반 시험법(Neuro-2a assay)의 표준화를 위한 노력이 대두되고 있다. Neuro-2a assay의 원리는 Neuro-2a 세포주에 Na+/K+ ATPase 억제제인 Ouabain(O)과 Na+ 채널 활성화제인 Veratridine (V)을 처리하여 과도한 Na+ 유입으로 인한 세포사멸을 유도한 상태에서, Na+ 채널 억제제인 PSP를 처리하게 되면 Na+ 유입이 차단되어 세포가 생존하는 것을 측정하는 것이다. 본 연구에서는 PSP 검출을 위한 Neuro-2a assay를 국내 연구 환경에 맞게 다양한 매개변수를 개선하여 최적 시험법을 확립하고자 하였다. 고려한 매개변수들은 세포밀도, 배양 조건 및 PSP 처리 조건 등으로, 그 결과는 아래와 같다. 초기 세포밀도는 40,000 cells/well로, 세포 배양시간 및 처리시간은 각각 24시간으로 설정하였다. 또한 최적 O/V 농도는 500/50 μM로 설정하였다. 본 연구에서 PSP 중 Saxitoxin (STX)에 대해서 O/V 처리가 된 상태에서 S자형 용량-반응 그래프가 도출되는 8가지 농도(368~47,056 fg/μl)를 확인하였고, Neuro-2a assay의 실험실 간 변동성 비교를 통해, 실험의 적정성 확인을 위한 5가지 Quality Control Criteria와 실험 데이터의 신뢰가능 범위(Data Criteria) 6가지를 설정하였다. 확 립된 조건으로 Neuro-2a assay를 진행한 결과 반수영향농도(EC50) 값은 약 1,800~3,500 fg/μl로 나타났다. 실험실 간 변동성 비교 결과, Quality Control Criteria 값 및 Data criteria 값의 변동계수(coefficients of variation (CVs))가 1.98~29.15% 범위로 산출되어 실험의 적정성 및 재현성이 확인되었다. 본 연구를 통해 우리나라에서 활용할 수 있는 PSP 검출용 Neuro-2a assay 시험법의 최적 조건 및 5가지 Quality control 기준을 제시하였고, PSP 중 대표적인 독소인 STX을 대상으로 Neuro-2a assay를 실시한 결과 유의한 EC50 값을 산출할 수 있었으며, 향후 국내 수산물을 대상으로 MBA를 대체할 수 있는 PSP 검출법으로 활용될 것으로 기대된다.
In Gamak Bay, Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) was first detected from seafoods in 2003, however the toxin source is unknown yet. In this study, we report potential PSP producers of toxic dinoflagellates, describing morphology and abundance of cysts isolated from surface sediment of Gamak Bay. The most abundant type in these cysts was characterized with ellipsoidal and transparent wall identical to Alexandrium catenella and/or A. tamarense. Germination experiment of the cysts revealed that all motile cells germinated were morphologically identified as A. tamarense. This result suggests that A. tamarense may relate to PSP contaminations in Gamak Bay. Moreover, bottom water temperature in Gamak Bay is favorable for germination of A. tamarense cysts. Further studies are required to carry out the PSP monitoring for preventing the risk of PSP events that may outbreak in future at Gamak Bay.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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