Microbial insecticide formulations were prepared by liquid and semi-solid fermentations using Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, HL-106 (BTK-HL106), B. thuringiensis subsp. israelensis HL-63 (BTI-HL63) and B. sphaericus 1593 (BS-1593) strains. The liquid fermentation medium contained molasses 2%, dextrose 1.5%, peptone 2%, D-xylose 0.025%, CaCl$_2$ 0.1%, K$_2$HPO$_4$ 0.1%, KH$_2$PO$_4$ 0.1%, MgSO$_4$$.$7H$_2$O 0.03%, FeSO$_4$$.$7H$_2$O 0.002%, ZnSO$_4$$.$7H$_2$O 0.02%. The composition of the semi-solid fermentation medium was rice bran 45.2%, zeolite 31%, yeast powder 0.02%, corn powder 5%, dextrose 3%, lime 0.3%, NaCl 0.06%, CaCl$_2$ 0.02%, and H$_2$O 15.42%. Insecticide formulations produced in the liquid fermentation named BTK-HL106, BTI-HL63 and BS-1593 pesticides and those in the semi-solid fermentation were designated as BTK-HL106-1, BTI-HL63-1 and BS-1593-1 pesticides, respectively. The number of spore (endotoxin crystals) was 2.65${\times}$10$\^$9/ spores per $m\ell$ in the BTK-HL106 and 3.5${\times}$10$\^$10/ in the BTK-HL106-1 3.8${\times}$10$\^$9/ spores in the BTI-HL63 and 7.0${\times}$10$\^$10/ in the BTI-HL63-1, and 7.5${\times}$10$\^$9/ in the BS-1593 and 1.4${\times}$10$\^$10/ in the BS-1593-1. The spores in the BS-1593 formulation was produced two times more than the other formulations. The spores in the BTI-HL63-1 were contained twice than those in the BTK-HL106-1, and five times than those in the BS-1593-1. The results indicated that spore (endotoxin crystals) productions in the semi-solid fermentation increased about ten times than those in the liquid fermentations. $LC_{50}$s of the BTI-HL63 and BS-1593 were 4.5 $\mu\textrm{g}$, and those of the BTI-HL63-1 and BS-1593-1 were 1.5 $\mu\textrm{g}$. $LC_{50}$ of the BTK-HL106 was 1.5 mg and that of the BTK-HL106-1 was 0.9 mg. The $LC_{50}$s of the formulations in the semi-solid fermentations showed about two to three times higher than those in the liquid fermentations.
갯벌 퇴적물에 존재하는 병원성 해양미생물인 Vibrio vulnificus를 신속하고 정확하게 검출하기 위해 PCR, Southern hybridization 방법과 real-time PCR을 수행하여 검출 민감도를 비교하였다. 갯벌 퇴적물로부터 bead beater를 이용한 물리적 방법으로 DNA 조추출액을 얻고 상용화된 키트 (Geneclean turbo Kit)를 이용하여 부식물질(humic substances)을 제거하였다. 병원성에 관련된 3 종의 유전자(hemolysin, vvhA; phosphomannomutase, pmm; metalloprotease, vvpE)를 대상으로 설계한 프라이머 셋을 동시에 사용하는 multiplex PCR 방법과 Southern hybridization과 병행한 방법(PCR/Southern hybridization)을 수행하였다. Real-time PCR은 hemolysin 유전자(vvhA)에 특이한 프라이머와 TaqMan 탐침을 사용하였다. 전처리하지 않은 갯벌 퇴적물의 경우, PCR/Sourthern hybridization과 real-time PCR 방법의 검출 민감도는 퇴적물 1 g 당 약 $10^2$ 개의 세포 수준이었다. 농후처리액(APW; alkaline peptone water)으로 $35^{\circ}C$에서 $2{\~}3$시간, 8시간 중균 배양할 경우 갯벌 퇴적물 1 g 당 $2{\~}10$개 세포가 존재할 때 PCR/Southern hybridization 방법과 real-time PCR 방법으로 각각 검출할 수 있었다. 전처리 과정을 포함하여 real-time PCR은 $6{\~}7$시간, PCR/Sourthern hybridization은 약 36시간이 소요되었다.
비병원성 야생효모들로부터 새로운 항염물질을 생산하고자 우리나라 주요 섬과 산에서 분리, 동정한 야생 효모들 중 비병원성 효모들의 무세포 추출물들을 제조하여 이들의 nitric oxide (NO) 생성 저해활성을 측정하였다. 182 균주 중 Metschnikowia reukaufii SY20-7, Rhodotorula ingeniosa SY1-1, Yarrowia lipolytica SY51-1, 51-3, Meyerozyma guilliermondii YJ34-2, Rhodotorula graminis YJ36-1, Rhodotorula nothofagi YJ1-1, YJ22-2, Metschnikowia koreensis UL32-1, Sporobolomyces carnicolor UL32-3 등 10 균주들의 무세포 추출물들이 30% 이상의 NO 생성 저해활성을 보였다. 이들 중 유포자효모들에서는 Rhodotorula graminis YJ36-1가 가장 높은 57.4%의 NO 생성 저해활성을 보였고 무포자효모들에서는 Meyerozyma guilliermondii YJ34-2가 47.0%로 가장높아 항염물질생산 우수효모로 최종 선발하였다. 선발된 야생효모들의 미생물학적 특성을 조사한 결과 Rhodotorula graminis YJ36-1 균주는 자낭포자와 위균사를 형성하였고 $25^{\circ}C$에서 잘 생육하였으며 Meyerozyma guilliermondii YJ34-2는 자낭포자와 위균사를 형성하지 않았고 $30^{\circ}C$, 5%의 NaCl 함유 YPD 배지에서도 잘 생육하였다. 또한, 두 효모 모두 pH 4.0~8.0에서 생육하였고 YM, PD, YPD, 비타민 무함유 배지 등에서 잘 생육하였다.
버섯 세균갈성색무늬병원균인 Pseudomonas tolaasii에 대한 길항미생물로 보고된 Pseudomonas azotoformans HC5 균주의 배양적 특성과 대량 배양을 위한 최적배양 조건을 설정하였다. HC5 균주의 생육온도는 $10{\sim}20^{\circ}C$, pH는 6.0~9.0의 범위에서 왕성한 생육을 보였다. 대량배양을 위한 효율적인 영양원 선발을 위하여 기본배지에 탄소원 fructose 등 18종, 무기질소원 $NH_4Cl$ 등 6종, 유기질소원 peptone 등 6종 그리고 아미노산 asparagine 등 11종을 각각 1%씩 첨가하였고, 무기염류 13종을 1 mM 농도로 첨가하여 각각에 대한 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 선발된 각각의 영양성분들에 대한 최적 농도를 조사하기 위하여 각각의 성분을 최소 0.1%에서 최대 4.0%까지 배지에 첨가하여 배양 후 생육정도를 조사하였다. 그 결과, 대량배양을 위한 생육최적조건은 온도 $15^{\circ}C$, pH 6, 탄소원 0.6% adonitol, 유기질소원 1.5% yeast extract, 무기질소원 0.8% $NH_4H_2PO_4$, 아미노산 0.2% asparagine 그리고 무기염류는 5 mM $MgSO_4$에서 왕성한 생육을 보였다.
버섯 세균갈성색무늬병원균인 Pseudomonas agarici에 대한 길항미생물로 보고된 Alcaligenes sp. HC12 균주의 배양적 특성과 대량 배양을 위한 최적배양 조건을 설정하였다. HC12균주의 생육온도는 $20{\sim}40^{\circ}C$, pH는 6.0 이상에서 왕성한 생육을 보였다. 대량배양을 위한 효율적인 영양원 선발을 위하여 기본배지에 탄소원 fructose 등 18종, 무기질소원 $NH_4Cl$ 등 6종, 유기질소원 peptone 등 6종 그리고 아미노산 asparagine 등 11종을 각각 1%씩 첨가하였고, 무기염류 13종을 첨가하여 각각에 대한 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 선발된 각각의 영양성분들에 대한 최적 농도를 조사하기 위하여 각각의 성분을 최소 0.1%에서 최대 4.0%까지 배지에 첨가하여 배양 후 생육정도를 조사하였다. 그 결과, 대량배양을 위한 생육최적조건은 온도 $30^{\circ}C$, pH 9, 탄소원 0.5% dextrine, 유기질소원 1.5% yeast extract, 무기질소원 1.0% $NaNO_3$, 아미노산 1.5% asparagine 그리고 무기염류는 0.5% $KH_2PO_4$에서 왕성한 생육을 보였다.
식초는 세계적으로 사용되는 조미료로 밀, 과일, 곡물 등을 원료로하여 다양한 방법으로 제조된다. 지금까지 식초에 대한 대부분의 연구들은 항산화활성에 한정된 연구였다. 본 연구에서는 현미를 이용하여 만든 현미 발효 식초의 이화학적 특성과 항균활성에 대해 시험하였으며, 현미발효식초의 항균활성은 paper disc-agar diffusion 방법을 이용하여 조사하였 때, 병원성 박테리아와 효모에 대해 강한 항균활성을 나타내었다. 특히 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica, and Lodderomyces elongisporus의 균주에 대해서는 상용되는 항생제인 카베니실린과 테트라사이클린보다 더 높은 항균활성을 보였다. 항산화활성은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능을 이용하여 측정하였고, 대표되는 항산화제인 아스코르빅 산과 비슷한 활성을 나타내었다. 현미발효흑초의 발효중에 나타나는 균주를 동정하기 위해 TSB 고체배지와 YPD 고체배지에 현미발효흑초를 도포하였을 때, 분리된 콜로니를 16S rDNA sequence 분석을 통하여, FDVS-1, 2, 3 세가지 균주를 분리하였으며, phylogenic tree 분석법을 이용하여 조사하였을 때, 각각 Acetobacter papayae, Acetobacter pasteuranus, Acetobacter peroxidans와 유사하였다.
대한민국 대천 해수로부터 agarase를 생산하는 균주 H9을 분리하였다. 본 균주는 16S rRNA 염기 염기서열 분석결과로부터 Pseudoalteromonas espejiana NCIMB2127T (98.98%), Pseudoalteromonas carrageenovora ATCC12662T (98.78%), Pseudoalteromonas atlantica IAM12927T (98.64%), Pseudoalteromonas issachenkonii KMM3549T (98.63%) 등과 높은 상동성을 보였다. 균주 H9은 genomic DNA 내 G+C 농도가 41.56%이고 주요 퀴논으로 quinone-8을 포함하고 있다. 균주 H9의 주요 지방산으로 C16:1ω7c (34.3%), C16:0 (23.72%), C18:1ω7c (13.64%) 등이 포함되었다. 이러한 유전적, 생리적 특성에 따라 균주 H9은 Pseudoalteromonas 속의 균으로 분류하여 Pseudoalteromonas sp. H9으로 명명하였다. 균주 H9이 세포외부로 분비하는 총 agarase는 40-45℃와 pH 7.0-8.0의 조건에서 높은 효소 활성을 갖으며, agarose를 분해하여 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 생산하였다. 균주 H9은 한천분해를 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 다양한 생리활성을 갖는 (neo)agarooligosaccharide는 기능성 식품, 화장품 등의 산업에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구는 전처리 방법이 새싹채소 재배에 사용되는 종자 중 식중독 세균의 검출율에 영향을 미치는지에 대해 검증하기 위해 시중 유통되고 있는 새싹채소 재배용 종자 19종을 수집하여 종자를 세척 방법과 발아 방법으로 전처리한 후 E. coli, E. coli O157:H7, Salmonella spp., L. monocytogenes의 검출율을 비교하였다. 또한 인위적으로 Salmonella enterica를 접종한 알팔파 종자에 대해서 무처리, 세척, 발아 방법으로 전처리한 후 S. enterica의 검출율을 검정하였다. 시중 유통되고 있는 종자를 수집하여 분석한 결과, 세척 방법과 발아 방법 등의 전처리 방법에 따라 E. coli 검출율과 양성시료에 차이가 있었음을 확인하였다. 인위적으로 S. enterica를 접종한 알팔파 종자에 대한 검출율 비교 검정에서도 분석시료량 대비 전처리방법별로 검출율이 차이가 나는 것으로 나타났고, 선택배지 종류에 따라서도 S. enterica의 검출율이 차이가 났다. 결론적으로 새싹채소 재배용 종자의 식중독 세균 분석에 있어서 종자의 전처리 방법, 시료당 분석시료량, 선택배지 종류 등이 검출율에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
국내 6개 지역에 걸쳐 채취한 토양 63점으로부터 1,000여 종의 방선균주를 분리하였다. 이들 균주의 배양 상징액 중 PLD의 생산이 양호한 균주를 탐색한 결과, 분해활성이 0.3U/$m\ell$이상인 131 균주를 일차로 선발하였다. 이중 전이 활성이 20% 이상인 균주는 23개였으며, 최종적으로 분해 및 전이활성이 가장 우수한 균주(방선균 KF923)를 선발하였다. 방선균 KF923 균주는 P 배지하에서 발효조 배양시 배양 48시간 후에 최고의 분해활성을 나타내었고(13U/$m\ell$) 전이활성은 95%로 나타났다. 방선균 KF923 균주가 생산한 PLD를 정제하여 비활성이 567U/mg의 PLD를 얻었다. 정제된 PLD는 분자량이 약 55kD으로 나타났고, 효소반응의 최적 pH는 6.0, 최적온도는 $60^{\circ}C$였으며, 효소의 안정성에 미지는 pH 및 온도의 영향은 pH 8.0부근 및 $40^{\circ}C$ 이하에서 가장 안정하였다. 또한, 특별한 금속이온의 요구성은 없는 것으로 나타났다. 방선균 KF923 균주가 생산한 PLD는 산업화에 충분히 활용 가능하며, 이를 위하여 효소의 대량생산 및 효소반응을 위한 공정개발 등의 연구가 필요하다고 생각한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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