• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제49권3호
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• pp.281-289
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• 2000

배경 : 결핵의 진단에 있어 결핵균 배양검사는 결핵의 확진 검사이지만 배양에 최소한 6-8주가 소요되어 진단 및 치료가 지연되는 단점이 있다. PCR 법은 신속하고 예민하게 결핵균을 검출할 수 있지만 위양성율과 위음성율이 높아 문제시 되고 있다. 최근에 개발된 LCR법과 PCR-Hybridization은 PCR 법 보다도 민감하게 결핵균을 검출할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이에 저자들은 하상균 배양을 기준으로 in house PCR, LCR 및 PCR- Hybridization 각각의 임상적 유용성을 알아보고자 한다. 방법 : 1998년 8월에 결핵진단을 위해 세브란스 병원 임상 병리과에 의뢰된 75검체를 대상으로 AFB 도말 염색 검사, 결핵균 배양 검사(3% Ogawa 배지, 8주간), in house PCR, LCR(Abbott LCx kit) 및 PCR Hybridization을 시행하여 각각의 민간도와 특이도를 평가해보았다. 결과 : 항산균 배양법을 기준으로 판단할 때 in house PCR, LCR(Abbott LCx kit) 및 PCR-Hybridization의 민감도는 각각 40%, 80%, 100%였고 특이도는 98.6%, 94.3%, 94.3%였다. 결론 : LCR법과 PCR-Hybridization은 결핵균 검출에 있어 우수한 민감도와 특이도를 보여 결핵의 조기진단에 유용할 것으로 사료된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제41권1호
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• pp.42-46
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• 1998

본 연구는 polymerase chain reaction (PCR)와 Southern hybridization을 이용하여 서로 붙어있는 나무가 한 나무인지 두 나무인지 규명하였다. 공시된 수종은 구지뽕나무와 무궁화이다. 구지뽕나무는 경상북도 성주군 금수면 봉두리 안새출 금수식당 앞에 있는 나무로 두 사람이 서로 안고 있는 형상인데, 한 나무의 두 가지인지 가까이 자란 두 나무가 붙었는지를 구별하기 어려운 나무였다. 다섯 종류의 PCR primer $(17{\sim}24-mers)$ 중 355 primer의 경우 한가지의 잎 DNA에서만 PCR 산물이 검출되어 이것을 방사선표지한 후 genomic Southern hybridization을 행하였던 바 이 probe와 결합하는 DNA 단편이 동일한 위치에서 검출되었으나 정도는 다르게 나타났다. 아울러 OPERON 10-mer kits A에 있는 20종류의 primer를 이용하여 PCR을 행한 결과 OPA01 primer (CAGGCCCTTC)에 의한 PCR 생성물은 동일한 위치의 band 뿐만 아니라 추가로 4개가 한가지의 잎 DNA에서 더 나타났다. 따라서 구지뽕나무는 두 나무가 연결되어 한 나무를 이루는 것으로 짐작된다. 또한 무궁화는 경상남도 합천군 청덕면 두곡리 청덕초등학교 내에 있는데 수령 50년 이상으로 멀리서 보면 한 나무의 형상을 하고 있으나, 가까이 다가가서 줄기의 아래부분을 보면 세 줄기가 붙어있는 형상을 하고 있다. 따라서 이 무궁화 역시 한 나무의 세 가지인지 세나무가 가까이 자라 붙었는지 PCR과 Southern hybridization 방법을 이용하여 규명하려 하였다. Southern hybridization 결과에 의하면 구지뽕나무의 분석에 사용한 probe와 결합하는 DNA 단편은 검출되지 많았으며, 35S primer에 의한 PCR 생성물은 동일하였으나 OPA04와 OPA13 primer의 경우 약간의 상이성을 보였다. 이러한 결과에 따라 무궁화는 한 나무의 세 가지인 듯하나 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.

• 미생물학회지
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• 제41권3호
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• pp.168-176
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• 2005

갯벌 퇴적물에 존재하는 병원성 해양미생물인 Vibrio vulnificus를 신속하고 정확하게 검출하기 위해 PCR, Southern hybridization 방법과 real-time PCR을 수행하여 검출 민감도를 비교하였다. 갯벌 퇴적물로부터 bead beater를 이용한 물리적 방법으로 DNA 조추출액을 얻고 상용화된 키트 (Geneclean turbo Kit)를 이용하여 부식물질(humic substances)을 제거하였다. 병원성에 관련된 3 종의 유전자(hemolysin, vvhA; phosphomannomutase, pmm; metalloprotease, vvpE)를 대상으로 설계한 프라이머 셋을 동시에 사용하는 multiplex PCR 방법과 Southern hybridization과 병행한 방법(PCR/Southern hybridization)을 수행하였다. Real-time PCR은 hemolysin 유전자(vvhA)에 특이한 프라이머와 TaqMan 탐침을 사용하였다. 전처리하지 않은 갯벌 퇴적물의 경우, PCR/Sourthern hybridization과 real-time PCR 방법의 검출 민감도는 퇴적물 1 g 당 약 $10^2$ 개의 세포 수준이었다. 농후처리액(APW; alkaline peptone water)으로 $35^{\circ}C$에서 $2{\~}3$시간, 8시간 중균 배양할 경우 갯벌 퇴적물 1 g 당 $2{\~}10$개 세포가 존재할 때 PCR/Southern hybridization 방법과 real-time PCR 방법으로 각각 검출할 수 있었다. 전처리 과정을 포함하여 real-time PCR은 $6{\~}7$시간, PCR/Sourthern hybridization은 약 36시간이 소요되었다.

• 대한수의학회지
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• 제44권1호
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• pp.99-103
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• 2004

The aim of the present study was to develop a sensitive and specific assay for the diagnosis of alcelaphine herpesvirus 1 (AlHV-1) which is a cause agent of malignant catarrhal fever in ruminants. A1HV-1 is a gamma herpesvirus, which is frequent latent, and it is often difficult to detect its antigens or specific nucleic acids because of its low genomic copies in the infected tissues. In this study, polymerase chain reaction (PCR)-dot blot hybridization (DBH) assay for detecting AlHV-1 DNA was developed and evaluated for its sensitivity and specificity as comparison with PCR and DBH alone. The developed PCR-DBH was more sensitive than PCR or DBH alone and also very specific. The results showed that the sensitivity of PCR-DBH were higher and stronger than those of PCR and DBH alone. This PCR-DBH assay can be applied efficiently to confirm the presence of AlHV-1 virus on clinical samples and to differentiate specifically between AlHV-1 infection and other viral infections.

• 한국수의병리학회지
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• 제6권1호
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• pp.1-5
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• 2002

A1celaphine herpesvirus 1 (AHV-1) is a causative agent of malignant catarrhal fever which is a fatal and a lymphoproliferative syndrome. AHV-1 is a gamma herpesvirus, which induces frequent latent infection and often difficult to detect its antigens or specific nucleic acids because of its low viral copies in the infected tissues. A new method, in situ PCR, is developed for the detection of AHV-1 nucleic acid in this study. Target sequences of AHV-1 open reading frame 50 gene were detected within AHV-1 infected MDBK cells. As compare with other molecular biological methods for the detection of AHV-1, in situ PCR was found to be more sensitive than in situ hybridization and to be less sensitive than nested PCR. However, nested PCR cannot afford to observe and differentiate AHV-1 infected cells. In situ PCR amplifies a target sequence within cells that can be visualized microscopically with increased sensitivity compared to detection by in situ hybridization. In situ PCR has wide applications for sensitive localization of low copy AHV-1 viral sequences within cells to investigate the role of viruses in a variety of clinical conditions and also provide the rapid, sensitive, and specific detection of AHV-1 infection.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제4권3호
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• pp.171-175
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• 1994

To find new crystal protein genes, we screened 42 Bacillus thuringiensis strains of serovar standards by Southern hybridization with a cryI-specific probe which was amplified from B. thuringiensis subsp. kurstaki HDl by polymerase chain reaction (PCR). Two strains, B. thuringiensis subsp. entomocidus HD9 and subsp. subtoxicus HD109, generated weak signals under the low-stringency hybridization conditions. Further analysis with Southern hybridization revealed that the two strains contained cryIB genes which are slightly different from those of B. thuringiensis subsp. thuringiensis HD2. These results were confirmed by PCR with cryIB-specific primers followed by the restriction analysis of PCR products.

• 한국동물위생학회지
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• 제37권1호
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• pp.29-33
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• 2014

This study aimed at finding a fast, sensitive, and efficient protocol for molecular identification of intracellular protozoa Toxoplasma (T.) gondii. For molecular detection of T. gondii, we developed a polymerase chain reaction coupled with dot blot hybridization assay (PCR/DBH). For DBH analysis, the amplified DNA of T. gondii tachyzoite was labeled by incorporation of digoxigenin. The DBH assay alone was capable of detecting down to $1{\times}10^4$ pg of T. gondii genomic DNA. The PCR alone was capable of detecting down to $1{\times}10^3$ pg of T. gondii genomic DNA, whereas the PCR/DBH assay was capable of detecting down to $1{\times}10^2$ pg of T. gondii genomic DNA, indicating that sensitivity of the PCR/DBH method was approximately 10 to 100 times higher than PCR or DBH alone. Our PCR/DBH assay will be useful for confirming the presence of T. gondii on the samples and differentiating T. gondii infection from other intracellular protozoa infections.

• 한국식품과학회지
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• 제35권3호
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• pp.470-474
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• 2003

식중독은 세균에 의한 발병이 대부분이다. 따라서 식품에서 식중독 원인균을 신속하게 탐색하게 식중독으로부터의 되면 피해를 줄일 수 있을 것이다. 고전적인 식중독 원인균 탐색은 증균, 선택적 배지를 이용한 isolation, 생화학적 특징을 활용하는 분석이 있으나 많은 시간이 소요되는 단점을 갖고 있었다. 본 연구는 16S rRNA gene(16S rDNA)로부터 얻은 DNA 염기 서열을 이용 식중독 원인균의 특이적 oligonucleotide probe을 제작 reverse dot blot hybridization과 PCR 방법을 이용하여 고전적인 방법보다 빠른 시간 내에 식품에서 원인균을 탐색 할 수 있었다. 우유를 인공적으로 본 연구에서 사용한 균주로 오염시킨 후 DNA를 추출하여 PCR 증폭산물과 oligonucleotide probe를 hybridization 시킨 결과 oligonucleotide probe를 hybridization 시킨 결과 oligonucleotide probe가 위치한 곳에서 발색 반응이 나타났다. 본 연구에서 본 연구를 통해 DNA microchip으로 활용 짧은 시간 내에 많은 종류의 식중독 원인균을 탐색 할 수 있는 가능성을 확인하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권10호
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• pp.1463-1470
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• 2010

E. coli has long been widely used as a host system for the manufacture of recombinant proteins intended for human therapeutic use. When considering the impurities to be eliminated during the downstream process, residual host cell DNA is a major safety concern. The presence of residual E. coli host cell DNA in the final products is typically determined using a conventional slot blot hybridization assay or total DNA Threshold assay. However, both the former and latter methods are time consuming, expensive, and relatively insensitive. This study thus attempted to develop a more sensitive real-time PCR assay for the specific detection of residual E. coli DNA. This novel method was then compared with the slot blot hybridization assay and total DNA Threshold assay in order to determine its effectiveness and overall capabilities. The novel approach involved the selection of a specific primer pair for amplification of the E. coli 16S rRNA gene in an effort to improve sensitivity, whereas the E. coli host cell DNA quantification took place through the use of SYBR Green I. The detection limit of the real-time PCR assay, under these optimized conditions, was calculated to be 0.042 pg genomic DNA, which was much higher than those of both the slot blot hybridization assay and total DNA Threshold assay, where the detection limits were 2.42 and 3.73 pg genomic DNA, respectively. Hence, the real-time PCR assay can be said to be more reproducible, more accurate, and more precise than either the slot blot hybridization assay or total DNA Threshold assay. The real-time PCR assay may thus be a promising new tool for the quantitative detection and clearance validation of residual E. coli host cell DNA during the manufacturingprocess for recombinant therapeutics.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제12권8호
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• pp.3517-3522
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• 2011

수인성 병원성 미생물에 의한 공중목욕탕의 오염은 질병발생의 원인이 된다. 본 연구에서는 공중목욕탕내에 존재하는 수인성 병원성미생물들을 확인하고자 하였다. 서울지역내의 30 곳 공중목욕탕에서 욕조수 시료를 채수하여 진행하였다. 수인성 병원성미생물의 검출은 0.45 ${\mu}m$의 여과막을 이용하여 전통적인 배양방법으로 분리 및 동정하였다. 분자생물학적 기법을 사용하기 위해 미생물학적인 배양을 하지 않고 핵산을 추출하여 16S rRNA유전자를 표적으로 polymerase chain reaction-reverse blot hybridization (PCR-REBA)을 실시하였다. 미생물학적 배양방법에서는 지표세균인 Escherichia coli와 Shigella spp.가 검출되었으며, 분자생물학적 기법인 PCR-REBA을 수행한 결과 E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Pseudomonas spp., Mycobacterium spp. 등의 수인성 병원성미생물이 7곳에서 검출되었다. 본 연구결과를 토대로 공중목욕탕의 욕조수내에 수인성병원성미생물에 의한 감염을 줄이기 위해 적절한 위생관리과 E. coli를 포함한 유해미생물을 선정하여 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 사료된다.