• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제45권6호
• /
• pp.1178-1187
• /
• 1998

연구배경 : Pyrazinamide(PZA)는 대식세포(macrophage)내의 결핵균에 주로 작용하는 항결핵약제로서 단기화학요법의 중요한 요소이다. 최근 서구에서 AIDS 발생의 증가와 함께 약제내성 결핵의 발생이 증가하면서 약제내성을 조기에 발견하려는 노력이 시도되고 있다. 현재 우리나라에서는 PZA 감수성 검사 대신에 pyrazinamidase(PZase) 활성도 유무로 PZA에 대한 내성여부를 판별하고 있다. 최근 결핵균의 PZase를 coding하는 pncA 유전자가 밝혀졌고 이 유전자의 돌연변이가 결핵균의 PZA 내성에 관여한다는 보고가 있었다. 이에 본 연구자는 결핵균의 pncA 유전자를 대상으로 한 PCR-SSCP 법으로 PZA 내성여부를 진단할 수 있는지 알아보기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방 법 : 환자에서 추출되어 배양후 대한결핵연구원에서 PZase 활성도가 확인된 44예의 결핵균주와 대한결핵연구원에서 공여받은 BCG-French Strain, BCG-Tokyo strain, 그리고 1예의 우형결핵균 배양검체를 대상으로 하였다. 검체에서 bead beater 법으로 DNA를 추출하였으며 pncA 유전자를 포함하는 561bp 분절을 중합효소연쇄반응으로 증폭하였다. 이 증폭된 DNA를 BstB I 제한효소로 절단한 후 폴리아크릴아마이드젤에서 SSCP를 시행하여 그 결과를 표준균주 H37Rv와 비교하였다. 결 과 : 44예의 결핵균 중 22예는 PZase 활성도 양성이었고 22예는 PZase 활성도 음성이었다. 양성 22 예중 18예(82%)에서 표준균주인 H37Rv와 동일한 band의 이동성을 보였고 4예는 다른 band의 이동성을 보였다. 음성균주 22예중 19예(86%)에서 H37Rv와 다른 band의 이동성을 보였고 3예는 H37Rv와 동일한 band의 양상을 보여서 두 검사방법간의 관련성 검증 결과 통계적으로 유의하였다 (p<0.01). 근본적으로 PZA에 내성을 갖는 BCG strains과 1예의 우형결핵균 모두 H37Rv와 다른 band의 양상을 보여주었다. 결 론 : 결핵균의 PZase를 coding하는 pncA 유전자를 이용한 PCR-SSCP 법은 PZA 내성의 진단방법으로 기대된다.

• 대한미생물학회지
• /
• 제34권6호
• /
• pp.561-571
• /
• 1999

Diagnosis of mycobacterial infection is dependent upon the isolation and identification of causative agents. The procedures involved are time consuming and technically demanding. To improve the laborious identification process mycobacterial systematics supported by gene analysis is feasible, being particularly useful for slowly growing or uncultivable mycobacteria. To complement genetic analysis for the differentiation and identification of mycobacterial species, an alternative marker gene, rpoB encoding the ${\beta}$ subunit of RNA polymerase, was investigated. rpoB DNAs (342 bp) were amplified from 52 reference strains of mycobacteria including Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) and clinical isolates by the PCR. The nucleotide sequences were directly determined (306 bp) and aligned using the multiple alignment algorithm in the MegAlign package (DNASTAR) and MEGA program. A phylogenetic tree was constructed with a neighborhood joining method. Comparative sequence analysis of rpoB DNA provided the basis for species differentiation. By being grouped into species-specific clusters with low sequence divergence among strains belonging to same species, all the clinical isolates could be easily identified. Furthermore RFLP analysis enabled rapid identification of clinical isolates.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제59권3호
• /
• pp.250-256
• /
• 2005

배 경 : FQ계 약제는 다제내성 결핵환자들의 치료를 위한 주용 2차 항결핵약제의 하나이다. 그러나 FQ계 여러 약제들 간 교차내성정도와 내성관련 유전자인 gyrA의 돌연변이간 관련성을 조사하게 되었다. 방 법 : 결핵균 중에서 OFX 내성인 63균주와 감수성인 10균주를 대상으로 Lowenstein-Jensen 배지에 CIP, LVX, MXF, GAT, SPX 등에 대한 교차내성을 조사하였다. 퀴놀론계 각 약제를 $0.5-3{\mu}g/ml$ 농도로 첨가한 배지에서, $2{\mu}g/ml$ 이상에서 균이 발육한 경우를 내성으로 판정하였다. OFX 내성인 균주의 gyrA 및 gyrB 유전자의 돌연변이가 잘 발생하는 곳을 염기서열 분석하여 약제별로 그 교차내성 양상을 비교하였다. 결 과 : OFX 내성인 63균주 모두가 CIP약제에서는 교차내성을 나타내었고, LVX에는 90.5%, MXF에는 44.4%, GAT에는 36.5%, SPX에는 46.0%가 교차내성을 보였다. 이들 내성균주의 81.0%가 gyrA 유전자에 돌연변이를 가지고 있었으며, 그 분포는 아미노산 88번, 90번, 91번, 94번에서 나타났다. 그 중에서도 Gly88Ala, Ala90Val, Asp94Ala 돌연변이는 제3세대 FQ계 약제인 MXF, GAT, SPX에 감수성을 나타내는 경향이 있었다. 한편 gyrB 유전자에서는 63개 OFX 내성균주 중 4균주만이 돌연변이를 나타내었으나, 이들과 gyrB 유전자내 돌연변이가 없는 균주들 사이에서 FQ의 내성에 관련해서 차이가 없었다. 결 론 : OFX 내성균 중에서 약 60% 정도가 제3세대 FQ계 약제에서 감수성을 보였다. 따라서 이 들 약제에 대해서는 별도로 감수성검사를 실시하여 처방에 활용한다면, OFX 내성환자의 치료를 크게 향상시킬 수 있을 것으로 판단되었다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제43권6호
• /
• pp.842-851
• /
• 1996

연구배경: Rifampicin(RFP)은 항결핵 단기지료의 근간이 되는 약제로서 RFP에 대한 내성을 다제약제내성의 지표로 보기도 한다. rpoB유전자는 RFP이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA poly-merase의 ${\beta}$-subunit을 coding하는 유전자이다. 다른 보고들에 의하면 RFP내성균주에서 rpoB유전자의 돌연변이가 관찰되고 특히 점돌연변이가 중요한 기전임이 알려지고 있다. 이에 저자는 rpoB유전자의 점돌연변이를 쉰게 관찰할 수 있는 PCR-SSCP법 을 이용하여 신속하게 RFP에 대한 내성여부를 확인할 수 있는지에 대하여 알아보았다. 방법: 전통적인 약제내성검사상 RFP에 내성을 보이는 25 배양균주와 RFP에 감수성인 27 배양균주 그리고 표준균주인 H37Rv를 대상으로 하였다. TR8, TR9 primer를 이용하여 rpoB 유전자의 511 codon에서 533 codon 부위를 포함하는 157bp의 DNA를 증폭한 후 폴리 아크릴아마이드젤 전기영동으로 PCR-SSCP를 시행하여 band의 이동양상을 비교하였다. 그리고 H37Rv 와 다른 band의 양상을 보인 균주에서 direct sequencing을 시행하여 H37Rv의 염기서열과 비교하였다. 또한 임상결과를 추적할 수 있었던 19예에서 임상결과와 전통적인 감수성검사 결과, 그리고 PCR-SSCP결과를 비교하였다. 결과: 1) PCR-SSCP결과로 RFP감수성 27균주 모두에서 H37Rv와 동일한 band의 양상을 보였고, RFP내성 25균주 모두에서 H37Rv와 다른 band의 양상을 보여서 전통적인 RFP 감수성검사와 rpoB유전자의 PCR-SSCP 사이에 100% 일치하는 결과를 보여주었다. 2) rpoB 유전자 돌연변이의 주된 기전은 점돌연변이였다. 3) rpoB 유전자의 PCR-SSCP 결과는 전통적인 RFP감수성검사나 항결핵치료의 임상경과와 잘 일치하였다. 결론: 결핵균 rpoB 유전자의 PCR-SSCP에 의한 돌연변이의 확인은 RFP내성 결핵균의 신속한 진단에 아주 유용한 검사로 기대된다. 향후 직접임상검체를 대상으로 한 연구가 필요하리라 사료된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제45권4호
• /
• pp.714-722
• /
• 1998

연구배경: Rifampicin은 항결핵 단기요법의 근간이 되는 약제로 rifampicin 내성용 다제내성의 지표이기도 하다. rpoB유전자는 rifampicin이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA polymerase의 $\beta$-subunit을 coding하는 유전자이며 rifampicin내성 결핵균의 약 96%에서 돌연변이가 관찰된다. 그러므로 rifampicin내성결핵을 빠르게 진단할 수 있는 유용한 방법을 확인하기 위하여 PCR-line probe법과 PCR-SSCP법을 이용하여 다음의 연구를 시행하였다. 방 법: 대한 결핵연구원의 약제감수성검사상 rifampicin 내성인 결핵균주 33예와 감수성인 결핵균주 12예를 대상으로 하였다. 각각 배양균 집락에서 DNA를 분리한 후, PCR-line probe법과 PCR-SSCP법을 이용하여 rifampicin 내성 여부를 단일맹검적으로 검사하였고, 이를 약제감수성검사 결과와 비교하였다. 결 과: PCR-line probe법으로는 내성균주 33예중 27예(81.8%)에서 rpoB 유전자의 돌연변이를 확인할 수 있었고, 감수성균주 12예는 모두 rpoB 유전자의 돌연변이는 없었다. PCR-SSCP 법으로는 내성균주 33예중 23예(69.7%)에서 rpoB 유전자의 돌연변이를 확인할 수 있었고, 감수성균주 12예는 모두 rpoB 유전자의 돌연변이는 없었다. Rifampicin내성균주에서 rpoB 유전자 돌연변이 검출율의 PCR-line probe 법과 PCR-SSCP법간의 차이는 없었다 (p=0.25). 결 론: PCR-line probe법은 PCR-SSCP법과 더불어 rifampicin 내성을 조기에 진단할 수 있는 좋은 방법으로 사료되며, 전통적인 약제감수성검사 결과를 기다릴 수 없는 국한된 환자에게 유용한 진단법으로 생각된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제55권1호
• /
• pp.41-58
• /
• 2003

연구배경 : 약제내성 결핵권의 조기 진단을 위해서, 최근 돌연변이 검출 및 질병의 진단 등에 새로운 기술로 대두되고 있는 올리고뉴콜레오티드 칩 기술을 이용하여 결핵균의 리팜핀, 아이소나아지드와 스트렙토마이신 내성과 관련된 rpoB, katG와 rpsL 유전자의 주요 돌연변이를 신속하고 정확하게 검출하고자 하였다. 방 법 : 리팜핀 내성 검출의 야생형 7개와 돌연변이형 13개, 아이소니아지드 내성 검출의 야생형 2개와 돌연변이형 3개, 그리고 스트렙토마이신 내성 검출을 위한 야생형과 돌연변이형 프로브 각 2종류를 고안한 후, 유리 슬라이드에 고정시켜 올리고뉴클레오티드 칩을 제작하였고, 약제내성을 가지고 있는 배양균주 55균주를 선택하여 PCR 증폭반응과 혼성화 반응을 실시한 후 비공초점 레이저 스케너를 이용하여 돌연변이를 검출하였다. 이를 염기서열방법으로 확인하여 돌연변이 다형성을 분석하였다. 결 과 : 리팜핀 내성은 코돈 531과 코돈 526에서 65%의 돌연변이를 검출하였고, 현재까지 보고되어 있지 않은 D516F의 새로운 돌연변이도 검출하였다. 아이소니아지드 내성은 S315T와 R463L 돌연변이가 45.2%로 검출되었고, 스트렙토마이신 내성은 K43R과 K88R 돌연변이가 78%로 검출되었다. 리팜핀 내성의 88%(35/40), 아이소니아지드 내성의 50%(20/42), 그리고 스트렙토마이신 내성의 78%(7/9)를 검출함으로써 현재까지 보고되어 있는 세가지 약제내성과 관련된 rpoB, katG와 rpsL 유전자의 주요 돌연변이는 대부분 검출할 수 있음을 확인할 수 있었고, 염기서열분석 결과와 비교하였을 때 모두 일치하는 결과를 얻음으로써 올리고뉴콜레오티드 칩의 유용성을 확인할 수 있었다. 결 론 : 따라서 본 연구에서 개발한 올라고뉴클레오티드 칩은 약재내성 결핵균의 조기 진단에 유용한 도구가 될 것으로 사료된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제13권6호
• /
• pp.949-954
• /
• 2003

The argG gene of Corynebacterium glutamicum encoding argininosuccinate synthetase (EC6345) was cloned and sequenced. The gene was cloned by heterologous complementation of an Escherichia coli arginine auxotrophic mutant (argG/sup -/). The cloned DNA fragment also complements E. coli argD, argF, and argH mutants, suggesting a clustered organization of the genes in the chromosome. The coding region of the argG gene is 1,206 nucleotides long with a deduced molecular weight of about 44 kDa, comparable with the predicted size of the expressed protein on the SDS-PAGE. Computer analysis revealed that the amino acid sequence of the argG gene product had a high similarity to that of Mycobacterium tuberculosis and Streptomyces clavuligerus. Two conserved sequence motifs within the ArgG appear to be ATP-binding sites which correspond to 2 of the 3 conserved regions found in sequences of all known argininosuccinate synthetases.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제44권6호
• /
• pp.1245-1255
• /
• 1997

연구배경 : 결핵균의 rpoB 유전자는 Rifampicim이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA polymerase의 $\beta$-subunit을 encoding하는 유전자이다. 최근 PCR-SSCP 등의 다양한 방법을 이용하여 rpoB 유전자의 돌연변이를 발견함으로써 결핵균 다제약제내성의 지표인 Rifampicin 내성을 조기에 진단할 수 있는 방법에 대한 여러 보고가 있다. 그러나 대부분 배양된 검체를 대상으로 하였고 객담등의 임상검체를 직접 대상으로 한 연구는 별로 없었다. 본 연구는 직접 임상검체를 대상으로 결균의 rpoB유전자 PCR-SSCP를 시행함으로써 rifampicin 내성을 신속히 진단할 수 있는지 알아보았다. 대상 및 방법 : 1996년 6월부터 8월까지 아산재단 서울중앙병원에서 항산성도말검사 양성인 75검체를 대상으로 하였다. 이종 결핵균의 IS6110분절을 이용한 중합효소 연쇄반웅이 양성이고 RFP 감수성검사 결과가 확인된 43검체를 대상으로 하였다. Bead beater법으로 DNA를 추출하여 heminested PCR을 시행하였고 MDE gel을 이용하여 SSCP를 시행하였다. 이 검체즐은 배양 즉시 대한결핵협회에 감수성검사를 의뢰하여 PCR-SSCP 결과와 rifampicin 감수성검사 결과를 비교하였다. 결 과 : 75검체중 55예(73%)에서 IS6110분절에 대한 PCR 양성이었다. 이중에서 RFP에 대한 강수성결과가 확인된 43예를 대상으로 하였다. 29예는 표준균주인 H37Rv와 동일한 전기영동상의 이동성을 보였고, 14예는 다른 이동성을 보여 주었다. 동일한 이동성을 보인 29예 모두 감수성검사상 RFP감수성으로 판명되었고, 다른 이동성을 보인 14예 모두 RFP 내성으로 판명되었다. 즉 기존의 전통적인 RFP 감수성검사 결과와 직접임상검체에서 rpoB 유전자를 이용한 PCR-SSCP분석은 100% 일치하였다. 결 론 : 임상검체에서 직접 rpoB 유전자의 heminested PCR을 이용한 SSCP 법은 Rifampicin내성을 신속히 진단할 수 있는 방법으로 기대된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제50권2호
• /
• pp.222-228
• /
• 2001

목 적 : 객담 항산균 도말 양성환자에서 direct amplification test (DAT) 양성이면 폐결핵으로 확진이 가능하다. 그러나 객담 항산균 도말음성이고 DAT는 양성인 경우에는 DAT 결과가 얼마나 신뢰성이 있는지 의문이었다. 따라서 저자들은 폐결핵이 의심되는 환자에서 객담 항산균 도말 음성이고 DAT 양성일 때 폐결핵진단에 있어서 DAT의 유용성올 살펴보고자 하였다. 방 법 : 1998년 6월1일부터 1999년 5월30일 까지 한림대학교 의료원에서 폐결핵이 의심되어 결핵균 항산균 도말, 배양검사 및 DAT를 시행한 909명을 대상으로 하였다. 활동성 폐결핵의 확진은 결핵균 배양 양성이거나 조직학적으로 건락성 육아종이 증명된 경우로 정의하였다. 임상적 폐결핵의 진단 조건은 방사선 소견상 결핵성 폐침윤이 의심되고 폐렴, 폐암 등이 배제된 환자로 결핵균 배양은 음성이나, 항결핵제 3개월 이상 투여 후 증상 및 방사선 소견상 호전이 있는 경우로 정의하였다. DAT는 Mycobacterium tuberculosis complex에 특징적으로 존재 하는 insertion sequence (IS6110)의 특정 부위만을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 TB-$CRkit^{TM}$(한국생공, 대전)를 이용하였으며, 특이도를 높이기 위해 nested PCR검사를 시행하였다. 결 과 : 대상 환자 909 명 중 객담 항산균 도말검사는 335명에서 양성(36.6%)이었으며, 객담 결핵균 PCR이 374명에서 양성(41.1%)으로 판명되었다. 객담 항산균 도말 음성이면서 객담 결핵 PCR 양성인 환자는 39명(4.3%)으로 남자 22명, 여자 17명 이었다. 객담 결핵 PCR 양성인 환자 39 명중 32명에서 폐결핵으로 진단되었다. DAT는 확진된 결핵환자만을 대상으로 할 때 61.5%의 양성 예측율을, 확진된 폐결핵 환자와 임상적으로 진단된 결핵환자를 대상으로 할 때 82.1% 양성 예측율을 나타냈었고 위양성율은 18.0%였다. 결 론 : 이상의 결과로 임상적으로 폐결핵이 의심되는 객담 항산균 도말 음성인 환자에서 객담 DAT 양성일 때 폐결핵의 조기 진단에 중요한 수단으로 이용 될 수 있을 것으로 사료되었다.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
• /
• 제13권6호
• /
• pp.475-482
• /
• 2009

Rifampicin is a macrocyclic antibiotic which is used extensively for treatment against Mycobacterium tuberculosis and other mycobacterial infections. Recently, a number of studies have focused on the immune-regulatory effects of rifampicin. Therefore, we hypothesized that rifampicin may influence the TLR2 expression in LPS-activated RAW 264.7 cells. In this study, we determined that rifampicin suppresses LPS-induced TLR2 mRNA expression. The down-regulation of TLR2 expression coincided with decreased production of TNF-$\alpha$ Since NF-${\kappa}B$ is a major transcription factor that regulates genes for TLR2 and TNF-$\alpha$, we examined the effect of rifampicin on the LPS-induced NF-${\kappa}B$ activation. Rifampicin inhibited NF-${\kappa}B$ DNA-binding activity in LPS-activated RAW 264.7 cells, while it did not affect IKK$\alpha/\beta$ activity. However, rifampicin slightly inhibited the nuclear translocation of NF-${\kappa}B$ p65. In addition, rifampicin increased physical interaction between pregnane X receptor, a receptor for rifampicin, and NF-${\kappa}B$ p65, suggesting pregnane X receptor interferes with NF-${\kappa}B$ binding to DNA. Taken together, our results demonstrate that rifampicin inhibits LPS-induced TLR2 expression, at least in part, via the suppression of NF-${\kappa}B$ DNA-binding activity in RAW 264.7 cells. Thus, the present results suggest that the rifampicin-mediated inhibition of TLR2 via the suppression of NF-${\kappa}B$ DNA-binding activity may be a novel mechanism of the immune-suppressive effects of rifampicin.