Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) was successfully applied to Monascus ruber. The optimum cocultivation time was 84 h with an efficiency of 900 to 1,000 transformants when $1{\times}10^6$ spores were used with the same volume of bacteria. The stability of transform ants was over 98% after five generations. When M. ruber was transformed with A. tumefaciens YL-63 containing the green fluorescent protein gene (egfp), the green fluorescent signal was observed throughout hyphae, confirming expression of the gene. This efficient transformation and expression system of M. ruber by ATMT will facilitate the study of this fungus at a molecular genetic level.
Optimized conditions for protoplast preparation and regeneration from young hyphae of Monascus ruber were established. Heat shock treatment of spores gave rapid and synchronized germination. Spores collected from cultures grown for 7-8 days at $30^{\circ}C$ were germinated until over 70% germ tubes reached to 3-5 spore length. Enzymatic digestion of young hyphae was optimal with 50 mg/mL Glucanex in 0.1 M sodium citrate buffer containing 0.8 M mannitol as an osmotic stabilizer. Regeneration rate was around 10% when 0.8 M sorbitol was used as an osmotic stabilizer in regeneration medium. These conditions will be applied in genetic study of M. ruber that produces citrinin at high level and thus is good model strain for molecular genetic dissection of citrinin biosynthesis.
To enhance the physiological activities of roasted coffee (RC), 30 kinds of green coffee beans (GCB) with different cultivating areas and varieties were fermented with Monascus ruber mycelium (MR) by solid-state culture. After the dried MR-fermented GCB was subjected medium roasting, each RC was extracted with hot-water. Among the hot-water extracts, the highest yield was the hot-water extract of RC from MR-fermented Indonesia Mandheling GCB (15.5%). However, the hot-water extract of RC from MR-fermented Ethiopia Sidamo GCB showed significantly higher polyphenolic contents (3.08 mg GAE/100 mg) and ABTS free radical scavenging activity (25.41 mg AEAC/100 mg). Meanwhile, the hot-water extract of RC from MR-fermented Vietnam Robusta GCB showed not only the effective inhibition of $TNF-{\alpha}$ level (73.7% inhibition of LPS-stimulated control) from LPS-stimulated RAW 264.7 cells but also significant inhibition of lipogenesis (63.5% inhibition of lipid differentiation control) in 3T3-L1 pre-adipose cells. In conclusion, these results suggest that roasted coffees from Ethiopia Sidamo and Vietnam Robusta green coffee beans fermented with Monascus ruber mycelium using solid-state culture could have industrial applications as functional coffee beverages.
The growth characteristics and production of color pigments by Monascus strains were investigated during liquid culture, and production of monacolin K in red mold rice was carried out by solid state fermentation. Four different Monascus ruber strains were cultured in potato dextrose yeast extract broth (PDYB) media at $25^{\circ}C$ for 15 days. The high producing strain for red pigment was not corresponded to the strain for yellow pigment. Production of red pigment was high in the strain causing the fast pH change in culture broth. Production of monacolin K in red mold rice by solid state fermentation was influenced by a combination of wet cell weight and spore density in inoculum by liquid culture. Most strains showed the high production of monacolin K in red mold rice, when submerged fermentation was carried out for 5 days as inoculum for solid state fermentation. These results suggest that submerged fermentation period of inoculum have an effect on the production of monacolin K in red mold rice by solid state fermentation, and monacolin K in red mold rice could be increased by controlling the condition of submerged fermentation for inoculum.
Monacolin K (MK) was produced on soybean using Monascus ruber GM011 by a two-stage-fermentation process. The optimal temperature was identified as $28^{\circ}C$. Higher yield was obtained by multiple-level-temperature cultivation than by single-level-temperature cultivation. The highest yield of total MK, 4.810 mg/g dry soybean product, was attained after 30 days of solid-state fermentation. No citrinin could be detected in the fermented soybean.
The purpose of this study was to optimize the solid state cultivation of Monascus ruber on sterile rice. A single-level-multiple-factor and a single-factor-multiple-level experimental design were employed to determine the optimal medium constituents and to optimize carbon and nitrogen source concentrations for lovastatin production. Simultaneous quantitative analyses of the ${\beta}$-hydroxyacid form and ${\beta}$-hydroxylactone for of lovastatin were performed by the high performance liquid chromatography (HPLC) method with a UV photodiode-array (PDA) detector. The total lovastatin yield ($4{\sim}6\;mg/g$, average of five repeats) was achieved by adding soybean powder, glycerol, sodium nitrate, and acetic acid at optimized levels after 14 days of fermentation. The maximal yield of lovastatin under the optimal composition of the medium increased by almost 2 times the yield observed prior to optimization. The experimental results also indicated that the ${\beta}$-hydroxylactone form of lovastatin (LFL) and the ${\beta}$-hydroxyacid form of lovastatin (AFL) simultaneously existed in solid state cultures of Monascus ruber. while the latter was the dominant form in the middle-late stage of continued fermentation. These results indicate that optimized culture conditions can be used for industrial production of lovastatin to obtain high yields.
항균활성을 나타내는 색소물질을 함유하고 있는 것으로 알려진 Monascus 균주 중 붉은 색소 생산력이 높은 6종의 Monascus 균주(M. araneosus KFRI 00371, M. kaoliang ATCC 46597, M. pilosus IFO 4520, M. purpureus IFO 4482, M. ruber IFO 32318 및 M. sp. ATCC 16437)로 홍국을 제조하고 색소 추출력이 높은 70% ethanol을 사용하여 추출물을 제조하였다. 6종의 Gram 양성균(Clostridium botulinum, Bacillus subtilis, B. cereus, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Listeria monocytogens), 3종의 Gram 음성균(Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris), 2종의 효모(Saccaromyces cerevisiae, Candida albicans) 및 1종의 곰팡이(Aspergillus flavus)에 대한 항균활성과 미생물 증식억제 효과를 측정한 결과 M. kaoliang ATCC 46597과 M. purpureus IFO 4482가 B. subtilis, B. cereus, M.luteus, S. aureus 및 S. typhimurium에 대해 항균활성을 갖는 것으로 나타났다. 두 균주 중 M. purpureus IFO 4482가 M. kaoliang ATCC 46597에 비해 활성이 높았으며, 특히 대표적 식중독균의 하나인 S. typhimurium에 대해 가장 높은 활성을 나타내었다. M.kaoliang ATCC 46597과 M. purpureus IFO 4482의 시험 미생물 증식억제효과를 측정한 결과 농도에 따른 증식억제효과가 나타났으며 이는 배양 48시간까지 지속적으로 유지되었다. 따라서 천연의 붉은색을 띄는 홍국 추출물이 식품의 천연착색제 및 보존제 소재로의 적용 가능성이 나타났다.
혈중 콜레스테롤 저하작용이 있는 monacolin K 고함유 홍국쌀 생산을 위해 2종의 홍국 균주와 7종의 쌀 품종을 사용하여 홍국쌀을 생산하였다. 생산된 홍국쌀의 monacolin K 함량을 분석한 결과는 다음과 같다. 1. 발효된 홍국쌀의 색은 균주에 비해 품종에 따라 차이가 크게 나는 경향이었으며, 상주찰벼가 붉은 색소 함량이 높았지만, monacolin K 생산량과 붉은 색소의 정도가 상관관계가 크다고 판단할 수 없다. 2. 홍국추출물을 UPLC로 이용하여 활성형 monacolin K와 비활성형 monacolin K가 분리 되었고, LC-MS/MS로 분자량을 확인한 결과, 활성형과 비활성형 monacolin K의 선구이온(precursor ion)은 각각 m/z 421, 405였고, 생성이온(product ion) 중 활성형은 m/z 101,319, 비활성형은 m/z 199, 285의 분자량을 확인하였다. 3. M. ruber KCTC6122과 M. ruber KCCM60141 균주를 이용하여 쌀 품종별로 생산한 홍국쌀의 monacolin K 함량을 분석한 결과, 상주찰벼가 각각 47.24, 117.03ppm으로 가장 많은 함량을 나타내었다. 4. 7종의 품종을 비교했을 때, M. ruber KCCM60141이 KCTC6122과 비교하여 monacolin K 생산량이 더 높은 균주이고, 그 중 상주찰벼를 이용하는 것이 홍국쌀 생산에 적절한 품종 선택이라고 판단된다.
좋은 아미노산 조성의 단백질과 높은 식이섬유 함량을 비롯한 좋은 영양조성을 가지고 있어 건강기능식품의 재료로 주목을 받고 있는 메밀에는 항산화효과, 혈압강하작용 등에 효과가 있는 것으로 알려진 rutin이라는 flavonol 배당체가 많이 함유되어 있다. 홍국의 제조에 쓰이는 Monascus속 곰팡이는 cholesterol 생합성 저해효과를 나타내는 monacolin K라는 대사산물을 생산하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 두가지 성분을 모두 함유한 건강기능식품의 제조를 위해 도정메밀과 발아시킨 도정메밀을 이용한 홍국을 제조하여 두가지 성분의 변화를 검토하였다. 도정메밀의 발아에 따른 rutin 함량은 초기에 약간 감소하였으나 싹의 길이에 비례하여 증가했고, 홍국균의 증식이 메밀에 함유된 rutin 함량에는 영양을 미치지 않는 것으로 나타났다. 발아시킨 도정메밀로 제조한 홍국의 monacolin K 함량은 발아시키지 않은 도정메밀에서 보다 낮게 나타났으며, 메밀 싹 길이의 증가에 따라 monacolin K 함량은 점차 감소하는 것으로 나타났다. 발아시킨 메밀을 이용한 홍국의 제조에서는 발아에서 오는 탄소원 및 영양분 감소가 홍국균의 증식에 영향을 주어 monacolin K의 함량을 떨어뜨리는 것으로 추정된다.
자연계로 부터 색소생산균을 분리하고 색고 생산성이 가장 양호한 YH-69를 동정한 결과, Monascus ruber의 근연균으로 동정되었따. 분리균의 색소 생산성을 분석한 결과, 탄고원은 200 mesh의 6% 쌀가루가 가장 우수하였으며,질소원은 0.2%의 yeast extract, 인산염은 0.3% ammonium sulfate, 무기염은 0.002% $ZnSO_4$에서 높은 생산성을 보였다. 가장 높은 생산성을 보인 인자들을 조한하여 최적의 배지를 구성하고 색소생산성을 조사한 결과, pH 5와 30${\circ}C$에서 높은 생산성을 보였으며, 배양 3일째로부터 색소생산성이 증가하여 배양 6일째 최고의 생산성을 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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