• 한국가축번식학회지
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• 제17권2호
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• pp.103-111
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• 1993

These experiments were undertaken to establish the optimal culture systems for in vitro maturation, fertilization and subsequently embryonic development of porcine immature follicular oocytes isolated from the ovary of slaughtered pigs. Porcine ovaries were brought to the laboratory from local slaughter house within 1 hour after slaughtering and cumulus oocytes complexes were recovered from antral follicles (3~5mm) with 23 gauge needle. To maturate follicular oocytes, cumulus oocytes complexes were washed three times with TCM-199 containing 25mM HEPES and incubated (39$^{\circ}C$, 5% CO2 in air) for 42hrs. Ejaculated and liquid storaged boar spermatozoa capacitated with different sperm capacitation methods and media were prepared forfertilizaing of matured follicular oocytes in vitro. Fertilization was performed by adding 5~10${mu}ell$ of capacitated spermatozoa containing 1~5$\times$105 sperm/ml to droplets. Eighteen to twenty-eight hours after sperm insemination, fertilized eggs were washed three times with culture media and transferred to the culture media. The fertilization rates of in vitro matured follicular oocytes cultured in B. O., TCM-HEPES, m-KRB, and TALP-II media were 61.3%, 83.0%, 88.9% and 89.2%, respectively. In addition, the polyspermy rates were 60.7%, 66.5%, 53.8%, and 43.9%, respectively. These data indicated that the highest of fertilization and the lowest of polyspermy rate was shown in TALP-II medium. Spermatozoa capacitated by caffeine, heparin, and percoll density gradient treatment in the 4 different media, the fertilization rates were 33.0~57.2%, 39.9~90.2%, and 52.6~92.8%, respectively, showing the lowest rate in caffeine treatment. The development rate of follicular oocytes, fertilized with the spermatozoa capacitated by caffeine, heparin, and percoll gradient in the TALP-II medium, upto 2 to 4-cell stages were 32.6%, 74.5% and 70.9%, respectively. Finally, fertilization rates of follicular oocytes cultured with follicular fluid containing medium from 10 to 100% were 61.2~94.1% and the rates (90~94%) with 10~20% follicular fluids were significantly higher than those (85.3%) of cultured in the media without follicular fluid. In addition, the rates of pronucleus formation were also higher in follicular fluid treated group (73.1~83.0%) than those (64.7%) of oocytes cultured without follicular fluid. The highest fertilization and pronucleus formation rates was found in oocytes cultured with 10% follicular fluid. These results suggest that the addition of heparin or percoll density gradient method is better capacitation method. Furthermore, the addition of porcine follicular fluid to the fertilization medium may improve the fertilization rates and formation of pronucleus.

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권3호
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• pp.179-185
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• 2002

본 연구에서는 vitrification방법을 사용하여 돼지 미수정란의 동결-융해시 난자생존능력에 대한특정 동해방지제 사용과 superoxide dismutase(SOD) 첨가의 영향을 검토하고자 수행하였다. 그 결과 미성숙 난자를 ethylene glycol과 DMSO 노출 후 성숙율(M-I에서 19.9%)이 glycerol과 DMSO 노출 후 성숙율(M-I에서 6.5%)보다 더 높았으며 ethylene glycol에 노출 후에는 M-I기로 성숙발달한 난자는 관찰되지 않았다. 한편. 미성숙 난자의 동결-융해 후 성숙배양시 SOD l unit/$m\ell$의 첨가시 (3.0%) 무첨가시(3.0%)와 성숙율이 같았으나 M-I에서 M-II 단계까지의 성숙율은 l unit/$m\ell$ 첨가 (65.0%)가 무첨가(54.0%)보다 높은 경향을 보였다. 또한, 성숙난자의 동결-융해 후 수정 시 정자 침입율은 lunit/$m\ell$ SOD 첨가(6.0%)의 경우 무첨가시 (3.7%)보다 더 높게 나타났다. 본 연구의 결과로부터 vitrifiration 방법을 이용 한 돼지 미수정란의 동결- 융해시 ethylenc glycol과 DMSO를 동해방지제로 사용하는 것이 효과적이며, 지질산화를 방지하기 위해 배양액에 l unit/$m\ell$의 SOD를 첨가하는 것이 동결-융해된 미수정란의 생존능력을 향상시키는 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제29권2호
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• pp.133-139
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• 2014

$K^+$ channels are involved in the regulation of a variety of physiological functions, including proliferation, apoptosis and differentiation, in mammalian cells. Our previous study demonstrated that the blockage of $K^+$ channels inhibits mouse early embryonic development. This study was designed to identify the effect of $K^+$ channels during bovine embryonic development. $K^+$ channel blockers (tetraethylammonium (TEA), $BaCl_2$, quinine, ruthenium red and fluoxetine) were added to the culture medium during in vitro fertilization (IVF) for 6 h to first identify the short-term effect of these chemicals. Among $K^+$ channel blockers, fluoxetine, which is used as a selective serotonin reuptake inhibitor, significantly increased the blastocyst formation rate by approximately 6% when compared to control. During the in vitro maturation (IVM) of immature oocytes and the in vitro culture (IVC) of embryos, the oocytes and embryos were exposed to fluoxetine for either a short-term (6 h) or a long-term (24 h) to compare the embryonic development in response to exposure time. The 6 h exposure to fluoxetine during IVM did not affect the blastocyst formation rate, but the rate of blastocyst formation was reduced after the 24 h exposure. On the other hand, embryonic development increased approximately 10% in both groups of embryos exposed to fluoxetine for 6 and 24 h during IVC. Taken together, fluoxetine treatment during IVF and IVC, but not IVM, enhances bovine embryonic development. These results suggest that fluoxetine-modulated signals in oocytes and embryos could be an important factor towards enhancing bovine embryonic development.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제13권1호
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• pp.11-19
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• 1986

Follicular flxid (FF) and their matched oocytes were obtained from 58 follicles of 27 women who underwent an in vitro fertilization (IVF) procedure with ovarian hyperstimulation by clomiphene citrate(n=8), hMG(n=9),FSH/hMG(n=10). Follicular aspiration was performed 36 hours after human chorionic gonadotropin administration. The concentcation of androstendione (ADD), testosterone (T) was correlated with hyperstimulation regimens, the morphology of the oocyte-corona-cumulus complex (OCCC), oocyte fertilization, and the incidence of pregnancy after embryo transfer. The results were as follows. 1. According to hyperstimulation regimens, there was no significant differance in FF ADD and T concentrations of the similar morphology of OCCC. 2. In clomiphene-treated and FSH/hMG-treated cycles, FF ADD concentrations of preovulatory oocytes were 43.09${\pm}$9.53 ng/ml and 59.46${\pm}$9.09 ng/ml, those of immature occytes were 96.98${\pm}$16.55 ng/ml and 116.13${\pm}$36.81 ng/ml, those of atretic oocytes were 246.5 ${\pm}$9.25 ng/ml and 634.25${\pm}$9.25 ng/ml respectively, reflecting the significant relationship between FF ADD level and morphologic maturity of OCCC (p<0.05). But in hMG-treated cycles, such relationship was not found (p>0.1). In clomiphene-treated and FSH/hMG-treated cycles, FF T concentrations of preovulatory oocytes were 11.37${\pm}$2.38 ng/ml and 11.68${\pm}$1.73 ng/ml respectively which were significantly lower than those of atretic oocytes (25.1${\pm}$7.50 ng/ml and 23.25${\pm}$0.95 ng/ml respectively) (p<0.05). But in all cycles, FF T concentrations of immature oocytes were not significantly different from those of preovulatory oocytes, artetic oocytes (p>0.1). 3. In hMG-treated and FSH/hMG-treated cycles, FF ADD concentrations of fertilized oocytes were 32.43${\pm}$4.09 ng/ml and 42.61${\pm}$4.82 ng/ml respectively which were significantly lower than those of non-fertilized oocytes (72.18${\pm}$17.31 ng/ml and 108.09${\pm}$17.32 ng/ml respectively) (p<0.05), but in clomiphene-treated cycles there was no significant difference (p>0.1). In FSH/hMG-treated cycles, FF T concentration of fertilized oocytes was 7.33${\pm}$1.06 ng/ml which was significantly lower than that of non-fertilized oocytes (20.3${\pm}$6.21 ng/ml) (p>0.02), but in clomiphne-treated and hMG-treated cycles there was no significant difference (p>0.1). 4. In all cycles FF ADD and T concentrations did not correlated with the success of pregnancy after embryo transfer. Above results suggested that FF ADD and T may play an important role in oocyte maturation and fertilization, but their relationship with the success of psegnancy was not found.

• 한국수정란이식학회지
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• 제10권2호
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• pp.131-138
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• 1995

Essential and non-essential amino acids supplemented to culture medium stimulate mammalian embryo development in vitro. Amino acids such as glycine, taurine and alanine are concentrated in the lumen of oviduct and uterus and it can he thought that these amino acids may have physiological role on fertilization and embryo development. Our aim of this experiment was to investigate the effects of essential and non-essential amino acids, taurine or glycine supplemented to fertilization medium on the cleavage and subsequent in vitro development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Immature oocytes were obtained from slaughtered Holstein cows and heifers and matured in TCM199 containing 10% fetal calf serum, 2.5 $\mu$g /mL of FSH and LH and 1 $\mu$g / mL of estradiol with granulosa cells in vitro. After maturation, oocytes were coincubated with sperm in fertilization medium supplemented with Minimum Essential Medium (MEM) essential and non-essential amino acids, taurine (3.75 mM) or glycine (10 mM) for 30 hours in vitro. Inseminated oocytes were cultured in synthetic oviduct fluid medium (SOEM) containing MEM essential, non-essential amino acids and 1 mM glutarnine up to 8 days after fertilization.Supplementation of fertilization medium with MEM essential and non-essential amino acids lowered significantly (p<0.05 and p<0.001) the cleavage rate after 30 hours of IVF (53.3%) and at Day 3 (62.7%: Day 0: the day of I VF) compared to control (64.3% and 77.3%, respectively). Subsequent developmental rates to morulae (Mo) and expanding blastocysts (ExBL) also significantly decreased (p<0.001 and p<0.05 for Mo and ExBL) when oocytes were coincubated with sperm in the medium containing MEM amino acids. Taurine added to fertilization medium have not increased the cleavage rate over the control, whereas glycine showed significantly lower (p<0.01) cleavage rate at Day 3 than that of taurine, but there was no significant difference in the developmental rates to Mo and ExBL of bovine embryos irrespective of the supplementation of taurine or glycine to fertilization medium. In conclusion, supplementation of fertilization medium with essential and non-essential amino acids, taurine or glycine has no beneficial effect on in vitro cleavage and development of bovine oocytes matured and fertilization in vitro.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권2호
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• pp.173-183
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• 2004

본 연구는 pFF, cysteine, ${\beta}$-mercaptoethanol, 성선자극호르몬 등 여러 가지 체외성숙 촉진 물질이 첨가딘 성숙배양액에 EGF 첨가가 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙에 효과적인지 또한 그 효가는 배양소적당 COC의 수에 영향을 받는지을 구명하고자 EGF의 첨가 유무와 배양소적당 COC수(50개 또는 15개)를 조합한 $2{\times}2$ 요인시험을 실시했다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 각 처리별로 mNCSU-23 에서 성숙배양하고 mTBM에서 운동정자의 최종동도가 $1{\times}10^5$sperm/mL 의 농도로 체외수정한 다음 NCSU-23 에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. 대조구와 EGF 첨가구에서 C4군의 COC 비율이 각각 41%dhk 82%로써 EGF 첨가가 난구세포의 팽화 정도를 크게 향상시키는 것으로 나타났으나, 난핵포 붕괴율과 핵성숙율에서는 EGF 첨가 여부나 배양소적당 COC 수에 따른 차이가 나타나지 않았고 두 요인간 상호작용도 없었다. 2. 정자 침투율, 웅성전핵 형성율 및 다정자수정 발생율에서도 EGF 첨가 여부나 배양소적당 COC 수에 따른 차이가 유의적인 것이 아니었고, 두 요인간 상호작용 역시 유의적이지 않았다. 3. 난분할율에서는 처리간에 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 배반포 발달율, 배반포의 ICM 세포수, TE 세포수 및 총세포수에서는 EGF 첨가구가 모두 유의적으로 높았다(p<0.01). COC수에 따른 차이나 두 요인간 상호작용에서는 유의성이 인정되지 않았다. 결과적으로 돼지 미성숙 난포란을 mNCSU-23에서 성숙배양할 때 10 ng/mL EGF 첨가는 성숙배양 단계에서 난구세포의 팽화를 더욱 심화시키고, 발달배양단계에서 배반포의 세포수와 배반포발달율을 증가시키는데 효과가 있는 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권2호
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• pp.187-194
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• 1998

본 연구는 돼지 수정란의 동결에 있어서 내동제의 종류, sucrose 농도, 평형시간 및 융해온도가 생존율에 미치는 영향과 미성숙 난자의 체외배양과 동결융해 후 생존율과 체외수정율을 조사하고저 수행하였다. 1. 수정란의 급속동결에 있어서 1.5 M glycerol, 2.0 M DMSO, 2.5 M ethyleneglycol 및 2.0 M propanediol 농도에서 생존율이 유의하게 높았으며, 내동제에 첨가된 sucrose농도는 0.25 M 첨가가 다른 농도에 비해 생존율이 높게 나타났다. 동결수정란은 3$0^{\circ}C$에서 융해시 생존율은 33.3~40.6%로서 $25^{\circ}C$ 및 37$^{\circ}C$의 융해온도에 비해 높게 나타났으며, 동결시 1.5 M 및 2.0 M glycerol＋0.25 M sucrose가 첨가된 내동액으로 짧은 평형시간(2.0~5.0분)이 긴 평형시간 (10~15분)보다 높은 생존율을 나타냈다. 2. 미성숙란을 1~8시간 체외배양시킨 다음 동결융해 후 체외수정시켰을 때 수정율은 6.7~26.7%로서 단시간의 체외성숙 배양이 높게 나타났으며, 또한 체외배양시 생존율은 10.0~30.0%를 나타냈다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제5권2호
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• pp.115-122
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• 2001

난자와 난포세포는 gap junction channel을 통해 긴밀한 연락을 주고받음으로써 난자의 발달이나 난포의 성장에 영향을 미친다. 본 연구는 같은 크기의 난포에서 나온 난자라고 하여도 cumulus cell(난구세포)들이 붙어있는 상태가 다르다는 것을 관찰, 이렇게 난구세포와의 서로 다른 연결상태를 갖는 난자의 재질에 차이가 있을 것으로 가정하고, 난자의 competence와 이때 난자와 난구세포 사이의 cell-to-cell communication에 관여하는 gap junction protein인 connexin(CX) 37과 CX 43의 발현 정도가 어떤 상관관계가 있는지를 알아보고자 수행하였다. 생후 3주일 된 생쥐에 PMSG를 주입하고 48시간 후에 난소를 적출하여 난포를 450 $\mu\textrm{m}$ 이상(large)의 난포와 200～400 $\mu\textrm{m}$(small) 난포로 분리하여 그 난자를 얻었다. 난자에 난구세포가 compact하게 붙어있는 것은 intact로(L1, Sl), 난구세포가 어느 정도 붙어 있거나, 하나도 붙어있지 않은 것은 partial/denuded로 그룹을 나누었다(LPD. SPD). 각 그룹의 난자를 체외에서 성숙시키고, 수정시켜서 발달율을 비교하였다. 각각의 CX의 mRNA 발현을 RT-PCR과 in situ hybridization으로 비교하였다. intact와 denuded 난자의 비율은 큰 난포의 경우는 55%와45%의 비율로, 작은 난포의 경우는 30%와 70%의 비율로 난포가 작을수록 denude상태의 난자가 많이 나왔다. 어떤 경우의 난자는 체외 성숙율은 차이가 없이 모두 97%이상 성숙하였다. 그러나, 수정률에서는 차이를 보여서 intact한 난자에서 높은 수정율을 보였으며, SPD의 경우, 가장 낮은 수정ㆍ발달율을 보였다. 난자의 경우, 주로 발현되는 것은 CX 37이었으며, CX 43은 발현되지 않았다. 난구세포의 경우, CX 43이 가장 높게 발현하였고, 그 다음으로 CX 37이 관찰되었다. 본 실험 결과, 같은 발달크기의 난포라고 하더라도 그 안에 존재하는 난자의 상태는 난구세포와 얼마나 밀접한 cell-to-cell communication을 이루고 있느냐에 따라 영향을 받는다는 것을 확인하였다. 본 연구결과 다음과 같이 결론 내릴 수 있었다. 1)아직 발달이 끝나지 않은 난포에서 나온 미성숙난자라고 하여도 난구세포와 밀접한 연결을 갖는 경우 성숙난자와 거의 같은 능력을 갖고 있으며, 2) 난자와 난구세포간의 gap junctional communication은 heterotypic channel로 이루어지고, 3) 본 연구에서 관찰한 CX 43과 CX 37 두 종류만으로는 intact와 denuded의 차이점을 설명할 수 없었다.

• 대한수의학회지
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• 제34권4호
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• pp.735-744
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• 1994

미성숙 래트의 외경정맥에 카테타를 장착하고, 다음날(28일령) 대조군에는 4IU, 다배란처치군에는 20IU의 PMSG를 피하 주사하였다. 각 실험동물은 혈중의 LH농도 변화를 측정하기 위하여 PMSG 투여직전(0시간), 투여후 12시간, 그 이후 6시간 간격으로 혈액을 채취하고 72시간에 희생시켰다. 그 결과 다배란용량의 PMSG 투여는 먼저 배란반응을 대조군에 비하여 4.0배나 현저하게(P<0.05) 증가시켰다. 또한 난관으로부터 회수된 다배란난자는 상당히 다른 감수분열상의 핵성숙도를 나타내었는데, 즉 prophase I이 14.7%, anaphase I이 36.2%, telophase I이 10.3%, metaphase I/II가 32.4%이었다. 그러나 대조군의 래트에서는 대다수(94.0%)의 난자가 한결같이 metaphase II상을 보였다. 그리고 혈청 LH농도는 radioimmunoassay(RIA)에 의하여 결정되었는데, 먼저 두군 모두 두개의 분명한 peak을 가진 경시적 변화관계를 보였다. 즉 이들 두군에 있어서 LH농도변화는 0-18시간대에 처음으로 완만한 증가와 54-60시간대에 두번째의 급격한 증가(surge)를 보였다. 그러나 두군간에 LH농도의 크기는 현저하게 달라, 다배란처치군의 동물에 있어서는 두번째의 LH peak에 앞서 전반적인 LH농도가 대조군보다 현저하게(P<0.001) 높았으나, FMSG 투여후 60시간에 일어나는 peak에 있어서는 LH농도가 대조군보다 현저하게(P<0.001) 54%나 낮았다. 덧붙여 두 peak간의 증가폭은 대조군에 비하여 다배란처치군에서 훨씬 낮았다. 다배란래트에 있어서 54시간 이전에 최초로 연속적인 증가를 보인 고농도의 혈청 LH는 실제적으로 투여된 PMSG와 측정시의 LH항체와의 교차반응(cross-reaction)에 의한 결과로 판명되었고, 한편 54시간과 60시간에 있어서 두번째로 급격한 증가를 보인 혈청 LH는 주로 뇌하수체로부터 분비되는 내재성 LH surge에 의한 것으로 사료된다. 본 연구 결과는 PMSG투여된 래트에 있어서 혈청 LH의 경시적인 변화상 및 그 특징을 정의한다. 그리고 전체적인 연구결과는 첫째, 다배란용량의 PMSG투여에 따른 배란반응의 증가가 주로 PMSG 자체에 함유된 고나도트로핀 작용과 연관이 있고, 둘째, 미성숙 또는 부동기적 핵성숙을 보이는 다배란난자의 회수는 최초의 혈청 LH의 연속적인 증가 및 이의 연이은 감퇴로 특징지워지는 LH활동도의 비정상적 혈중변화에 기인함을 시사한다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제29권3호
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• pp.273-281
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• 2014

This study was carried out to establish the system of OPU derived embryo production, management of recipients as well as offspring production. OPU derived embryo production system was carried out of aspiration of immature oocytes 2 times per week, total 24 times for 3 months by an ultrasonographic guided follicular aspiration system and then produced in vitro-produced blastocysts by in vitro maturation, fertilization and culture system. This work was collected total 13,866 oocytes, average $8.2{\pm}4.5$ oocytes per session and 8,170 G1 + G2 grade oocytes, average 4.8 oocytes per session by 1,692 times session of total 71 donors for 4 years from 2010 to 2013. The rate of cleavage and blastocyst developmental competence were obtained 11,825 (85.3%) and 5,032 (36.3%) that was $7.0{\pm}3.8$ cleaved embryos and $3.0{\pm}2.5$ blastocysts per session. OPU derived embryo transfer were taken place in 2, 4, 6 and 7 local governments at 2010, 2011, 2012 and 2013 for 4 years and pregnancy rate were obtained 41.2, 43.9, 46.5 and 49.7% in each years. It means that pregnancy rate was continuously improved according of every year for 4 years. Pregnancy rate was significantly different according to individual local government in which was 62.7% in B, but 24.2% in F at 2012. Paternity identification was carried out total 26 offspring in C local government of 2012 and then confirmed 100% agreement of its analysis. In conclusion, the results obtained the possibility of mass production of elite cow embryos as well as offspring by OPU derived embryo production system, of which could be decreased the required time of genetic improvement.