Marine birnavirus(MABV)는 중요한 어류 병원체로서 일본 양식산 방어서 처음 분리되어 이후 다양한 해산어종에서 MABV 분리가 보고되었으며 환경적인 샘플인 저질, 해양의 동물성 플랑크톤과 해수에서도 MABV 유전자가 검출되고 있다. 본 연구는 Marine birnavirus disease 에 대한 예방학적 접근의 일환으로서 자연산 어류로부터의 MABV 검출 및 지리적 분포, 보균 어종에 대한 유전학적인 조사를 목적으로 2003년과 2005년도에 동중국해역 3지점, 서해안 5지점 그리고 남해안 5지점에서 어류를 채집하였다. RT-PCR(Reverse transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 이용한 연구결과 자연산 해산어류 160마리 중 13종 17마리에서 MABV가 거출되어 감염율10.6%를 보였다. 조사된 13종의 어류 중 특히 농어목에서 가장 높는 검출율을 보였다. 자연산 어류에서 분리한 MABV 분리균주는 염기서열 분석에서 94.7%-100%, 아미노산 분석에서 97.2-100% 유사성을 나타내었으며 IPNV strain과는 구분되며 MABV에 속하였다.
Marine birnavirus (MABV)에 무증상적으로 감염된 넙치 (Paralichthys olivaceus) 치어에 면역억제제의 일종인 Dexamathasone을 투여하였을 때 MABV의 감염강도에 영향을 미치는가를 조사하였다. Real time PCR 분석결과 dexamethasone을 투여한 그룹이 생리식염수를 주사한 그룹 및 no handling 그룹에 비해 유의적으로 낮은 Ct 값을 나타냈으며, 또한 semi-quantitative RT-PCR 분석결과에 있어서도 dexamethasone을 주사한 그룹이 대조구 그룹들에 비해 MABV 유전자가 유의적으로 높게 증폭되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 dexamethasone 투여가 넙치 치어에 감염된 MABV의 복제를 증가시킴을 확인하였다.
우리나라 연안의 9곳의 지역에 위치한 넙치종묘생산장의 성숙 친어 및 친어용 자연채집어를 대상으로 각각의 생식소를 채집하여 체내 MABV 감염상황을 PCR법을 이용하여 검색한 결과 검사어의 34%가 MABV 감염 양성반응을 나타내었다. PCR 반응양성 어류의 샘플로부터 CHSE-214 세포주를 이용한 바이러스의 배양을 행한 결과, 친어 체내 생식소에 있어 바이러스 감염가가 $10^{2.30}$에서 $10^{4.30}$$TCID_{50}$/g(ml)의 titer를 보여, 정상적인 친어로 보이는 개체내의 바이러스 잠복감염이 인정되었다. 각각의 다른 어체로부티 분리되어진 바이러스는 중화반응에 따른 검토결과 동일종의 MABV임을 확인할 수 있었다. 종묘생산용으로 관리중인 넙치 친어로 부터 MABV의 잠복감염 확인으로 친어를 매개로한 감염의 가능성이 확인되어졌다.
경북 울진 지역에서 채집된 양식 강도다리와 충남 태안 및 부산 지역 넙치 시료로부터 분리한 MABV에 대한 유전자 비교를 위해 VP2-NSPhylogenetic VP3 region (432 bp)을 phylogenetic 분석에 이용했다. Sequence 확인 결과 MABV (08-KU)는 일본 방어에서 최초 분리 보고된 YTAV와 98%의 nucleotide 유사성이 나타났으며, 이전 보고된 다 른 여러 strain들과는 76%이상 유사한 것으로 확인되었다. 그리고 MABV (06-KP)와 MABV (08-KC)도 YTAV와 97-98%의 높은 sequence 유사성을 보였다. 또한 다양한 MABV strain들과의 비교를 위해 충남태안 및 부산지역 넙치 시료에서 분리한 MABV (08-KC)와 MABV (06-KP)에 대한 phylogenetic 분석도 실시하였다. 그 결과 분석에 사용된 MABV (08-KU0, MABV (06-KP), MABV (08-KC)는 모두 일본 방어에서 분리된 MABV Y6와 동일한 genogroup VII에 포함 되었다.
We developed and subsequently characterized mouse monoclonal antibodies (mAbs) against marine birnavirus (MABV). Eight hybridoma clones secreting mAbs against MABV were established. All eight mAbs (8G6, 11C3, 15E3, 17H6, 32A6, 35A7, 38B5, and 47E3) were reacted with viral protein 3 of MABV in MABV-infected CHSE-214, whereas, no reactivity was observed in normal CHSE-214 by western blot analysis. Moreover, these eight mAbs were strongly reacted with MABV, and no cross-reactivity has been observed against other five fish viruses (hirame rhabdovirus, infectious hematopoietic necrosis virus, nervous necrosis virus, spring viraemia of carp virus, and viral hemorrhagic septicemia virus), although five mAb (11C3, 15E3, 17H6, 32A6, and 38B5) reacted with both MABV and infectious pancreatic necrosis virus by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). These results indicate that the mAbs can be of value in MABV detection.
Eukaryotic translation is initiated by either cap-dependent or cap-independent way, and the cap-independent translation can be initiated by the internal ribosomal entry site (IRES). In this study, to know whether the 5'UTR leader sequence of marine birnavirus (MABV) segment A and segment B can act as IRES, bicistronic vectors harboring a CMV promoter-driven red fluorescent gene (mCherry) and poliovirus IRES- or MABV's leader sequence-driven green fluorescent gene (eGFP) were constructed, then, transfected into a mammalian cell line (BHK-21 cells) and a fish cell line (CHSE-214 cells). The results showed that the poliovirus IRES worked well in BHK-21 cells, but did not work in CHSE-214 cells. In the evaluation of MABV's leader sequences, the reporter eGFP gene under the 5'UTR leader sequence of MABV's segment A was well-translated in CHSE-214 cells, indicating 5'UTR of MABV's segment A initiates translation in the cap-independent way and can be used as a fish-specific IRES system. However, the 5'UTR leader sequence of MABV's segment B did not initiate translation in CHSE-214 cells. As the precise mechanism of birnavirid IRES-mediated translation is not known, more elaborate investigations are needed to uncover why the leader sequence of segment B could not initiate translation in the present study. In addition, further studies on the host species range of MABV's segment A IRES and on the screening of other fish-specific IRESs are needed.
Kim Yeong Jin;Choi Won Chul;Kim Hyeung Rak;Jung Sung Ju;Jung Tae Sung;Kim Jae Ho;Yeo In Kyu;Oh Myung Joo
Fisheries and Aquatic Sciences
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제3권1호
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pp.49-51
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2000
This study was performed to confirm the relationship between viral propagation and apoptosis by the infection of marine birnavirus strain (MABV NF-4) on chinook salmon embryo (CHSE-214) cells. After 6 hr viral infection, MABV was detected by PCR method. Also, as a result of DNA assay on the cells, MABV infection resulted in a typical feature of apoptosis, DNA fragmentation. The results suggest that MABV replicated to high concentrations during the early stage of infection induces apoptosis.
본 연구는 2002년 6월부터 2003년 11월까지 복수증을 나타내는 양식넙치의 세균상과 virus를 동정한 것이다. 생화학적 성상을 기초로 한 표현형으로, 병어체의 복수, 간, 신장, 내장으로부터 Vibrio, Edwardsiella, 및 stonella 등 3개 속이 동정되었다. Vibrio속은 5종으로 우점이었고 V. harveyi (32균주), V. parahaemolyticus (23균주), V. alginolyticus (10균주), V. carcariae (2균주), V. metschnikovii (5균주)였다. 그밖에 Photobacterium damselae (6균주)와 장내세균인 Edwardsiella tarda (15균주)가 동정되었다. 감염어의 내부 장기로부터 해산어 병원성 바이러스로 알려진 marine birnavirus (MABV)가 분리되었다.
해양버나바이러스(MABV)는 여러 종의 해양생물에 감염되며 숙주역이 넓다. 다양한 종의 숙주에 감염되었을 때의 MABV의 감염 특성을 규명하기 위하여, 주화세포 내에서 바이러스를 10대 계대 배양하여 in vitro로 연구했다. CHSE-214, RTG-2와 RSBK-2세포에서는 전형적인 CPE를 보이며 많은 양의 바이러스가 생산되었고, 높은 바이러스 단백질의 발현도 관찰되었다. 이에 반하여, EPC, FHM과 BF-2세포에서는 형광항체법에 의하여 바이러스단백질은 검출되었으나 CPE는 나타나지 않았다. EPC와 FHM 세포에서는 계대를 할수록 바이러스의 역가가 높아져, 바이러스의 숙주세포에의 적응이 일어난 것으로 보인다. 플라크의 크기는 CHSE-214, RTG-2와 RSBK-2세포에서 계대한 것이 다른 세포에서 계대한 것보다 커, 숙주세포의 종류에 따른 변이가 바이러스에 일어난 것으로 추측되었다. 게놈분절 A에 존재하는 VP2/NS 경계영역의 염기배열에서는 195번째의 염기에 특이적인 변이가 보였다. 숙주세포의 종류에 따라 다른 MABV의 감염특성은 자연계에서 다양한 숙주종에서 일어나는 in vivo에서의 감염특성을 반영하는 것으로 생각된다.
The objective of the study was to clarify the mechanism of persistent infection of marine birnavirus (MABV) in various nonpermissive cell lines. It was observed in CHSE-214, RTG-2 and RSBK-2 that the virus produced at high yield with typical cytopathic effect (CPE). On the contrary, the CPE was not produced in EPC, FHM and BF-2 cells. However amount of virus protein in both permissive and nonpermissive cell lines detected by ELISA was almost the same. Electron microscopy showed virions in permissive cells but not in nonpermissive cells. From the results, it is clear that virus protein and RNA were produced in nonpermissive cells as observed in permissive cells; however, assembly of the virus particles did not occur in nonpermissive cells.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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