• 한국미생물·생명공학회지
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• 제39권4호
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• pp.337-344
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• 2011

이전 연구에서, bacteriophage ${\Phi}FC1$이 Enterococcus faecalis KBL703에서 UV induction을 통해 분리 동정되었으며, ${\Phi}FC1$은 phage attachment site인 attP와 bacterial attachment site인 attB 사이에서 site-specific integration을 촉매하는 integrase를 가지고 있다는 것을 밝혀냈으며 이를 MJ1이라 명명하였다. 이 연구에서는 이를 바탕으로 MJ1에 의한 site-specific integration의 효율을 Escherichia coli와 NIH3T3 cell에서 확인 하기 위해 attP, attB, MJ1을 각각의 벡터에 삽입하였다. MJ1 인테그라제에 의한 재조합을 수행하기 위해서 기질 벡터 pABLP를 $DH5{\alpha}$에 형질전환시킨 후, LB 배지에서 $37^{\circ}C$ 1시간 배양한 후 암피실린(ampicillin)과 테트라싸이클린(tetracycline) 항생제 플레이트로 pGMJ1과 pABLP 같이 가지고 있는 colony 들을 선별하여, LacZ 유전자가 불활성화 된 흰색 콜로니 개수를 세고 통계를 낸 결과 integration의 frequency가 99% 이상인 것으로 나타났다. 또한, 실제로 재조합이 일어났는 지를 확인하기 위해서 콜로니 PCR을 수행하여 재조합의 산물인 attL 150 bp을 확인하였다. PCR 산물은 염기서열분석을 통해 정확한 site-specific integration이 일어났음을 확인하였다. MJ1에 의한 integration을 보이기 위해 attP와 attB를 가지고 있는 vector를 MJ1 expression vector와 함께 NIH3T3 cell에 cotransfection 했으며 GFP를 reporter로 사용해 그 activity를 관찰하였다. NIH3T3 cell에서 GFP의 발현을 형광 현미경을 통해 알아본 결과, MJ1에 의한 sitespecific integration이 다른 accessory protein의 도움 없이 일어난다는 것을 볼 수 있었다. 마찬가지 방법으로, attR과 attL 간의 excision을 GFP로 알아본 결과, GFP는 발현하지 않았으며, 이는 MJ1에 의한 excision이 일어나지 않았음을 보여주었다. 이와 같은 결과로 볼 때, MJ1의 host만이 아니라 넓은 범위안에서도 integration을 수행할 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서 MJ1을 이용한 site-specific integration system의 개발은 gene therapy를 위한 gene delivery system의 구축에 있어서 좋은 시작이 될 수 있다.

• International Journal of Oral Biology
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• 제33권3호
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• pp.105-111
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• 2008

Thrombospondins (TSP-1, TSP-2) are secretory extracellular glycoproteins that are involved in a variety of physiological processes such as tumor cell adhesion, invasion, and metastasis. The present study was undertaken to elucidate the involvement of thrombospondins in the adhesion of osteoblast-like cells using the TSP-1 or TSP-2 antisense MG63 and MC3T3-E1 cell lines. For downregulation of TSPs expression, we prepared antisense constructs for TSP-1 and TSP-2 using the pREP4 an episomal mammalian expression vector, which be able to produce the specific antisense oligonucleotides around chromosome. MG63 and MC3T3-E1 osteoblast-like cells were transfected with the antisense constructs and nonliposomal Fugene 6, and then selected under hygromycin B (50 ${\mu}g/ml$) treatment for 2 weeks. Western blot analysis revealed that expression of the TSP proteins was downregulated in the antisense cell lines. The cell adhesion assay showed that adhesive properties of TSP-1 and TSP-2 antisense MG63 cells on the polystyrene culture plate were reduced to 17% and 21% of the control cells, respectively, and those of the TSP-1 and TSP-2 antisense MC3T3-E1 cells also decreased to 19% and 27% of control, respectively. Adhesion of TSP-1 and TSP-2 antisense MC3T3-E1 cells on Type I collagen-coated culture plate decreased to 27% and 76%, respectively. These results indicate that TSP-1 and TSP-2 proteins may have an important role in adhesion of osteoblast-like cells to extracellular matrix.

• Toxicological Research
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• 제15권1호
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• pp.79-87
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• 1999

To know the stress response and antioxidative effect of sulfur containing compounds, we observed the expression of the stress protein (heat shock protein; inducible protein) from mouse tissues and evaluated the protective effects to hydroxyl radical in mouse brain cell culture. Cysteine, methionine or sodium sulfide was fed by oral administration of 1 ml/per 6hr/three times with 1 mM, 2mM or 3mM to mouse, respectively. After that, the stress proteins were extracted from mouse tissues and analyzed the features of expression. The stress proteins by sulfur containing compounds were showed different aspects in the kinds and concentrations of their compounds, and in the tissues of mouse. In the liver, the stress proteins were appeared at different time on the concentration of sulfur containing compounds and had less than 20 KDa as small molecules. In general, the molecular weights of stress protein in liver, the stress proteins were appeared at different time on the concentration of sulfur containing compounds and had less than 20 KDa as small molecules. In general, the molecular weights of stress protein in the spleen were evaluated from 32KDa to 50KDA, and the induced times were relatively late at high concentration of cysteine, early at low concentration of methionine or sodium sulfide. The stress proteins in mouse muscle were detected mostly between 24hr after treatment of sulfur containing compounds. Their molecular weights were 15~24KDa. In the antioxidative effects of sulfur containing compounds to hydroxyl radical, cell viabilities were measured by 63.2% at 10 $\mu\textrm{M}$, 65.5% at 50 $\mu\textrm{M}$, 68.6% at 100 $\mu\textrm{M}$, 78.3% at 150 $\mu\textrm{M}$, or 83.0% at 200 $\mu\textrm{M}$ of cysteine, respectively. At addition of methionine, the cell viabilities were assessed as 58.1% at 10 $\mu\textrm{M}$, 62.8% at 50 $\mu\textrm{M}$, 75.7% at 100 $\mu\textrm{M}$, 78.6% at 150 $\mu\textrm{M}$, and 79.2% at 200 $\mu\textrm{M}$ after 4hrs exposure with 20mU/ml glucose oxidase (GO) system, while the numbers of live cells to hydroxyl radicals in treatment of sodium sulfide were showed 48.6% at 10 $\mu\textrm{M}$, 54.8% at 100 $\mu\textrm{M}$, 51.8% at 150 $\mu\textrm{M}$, and 51.6% at 200 $\mu\textrm{M}$ in the neuronal cells. In the inhibitory effects on the proliferation of tumor cells, percentages of dead cells of the CT-26 or HeLa cell were generally less than 30% even 48hr after addition of sulfur containing compounds. Conclusively, the results of these experiments indicate that stress protein by sulfur containing compounds can be used as physiological indicator for animal nutrition and for environment, and also that cysteine and methionine can play critical roles as an antioxidant.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제15권14호
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• pp.5867-5872
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• 2014

Background: Cervical cancer is listed as one of high-incidence endemic diseases in Xinjiang. Our study aimed to evaluate the expression of TLR9 in uterine cervical tissues of Uyghur women and examine associations with clinicopathological variables. We further characterized the direct effects of TLR9 upon the selective silencing of human papillomavirus (HPV) E6 and E7 oncoprotein expression in HPV 16-positive human cervical carcinoma cells treated with siRNA in vitro. Materials and Methods: Immunohistochemistry was applied to evaluate TLR9 expression in 97 formalin-fixed paraffin-embedded cervical samples from Uyghur women; 32 diagnosed with cervical squamous cell carcinomas (CSCC), 14 with low-grade cervical intraepithelial neoplasias (CINI), 10 medium-grade (CINII), 24 high-grade (CINIII), and 17 chronic cervicitis. $BLOCK-iT^{TM}$ U6 RNAi Entry Vector $pENTR^{TM}$/U6-E6 and E7 was constructed and transfected the entry clone directly into the mammalian cell line 293FT. Then the HPV 16-positive SiHa human cervical carcinoma cell line was infected with RNAi recombinant lentivirus. RT-PCR and Western blotting were used to determine the expression of TLR9 in both SiHa and HPV 16 E6 and E7 silenced SiHa cells. Results: Immunohistochemical staining showed that TLR9 expression was undetectable (88.2%) or weak (11.8%) in chronic cervicitis tissues. However, variable staining was observed in the basal layer of all normal endocervical glands. TLR9 expression, which was mainly observed as cytoplasmic staining, gradually increased in accordance with the histopathological grade in the following order: chronic cervicitis (2/17, 11.8%)

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제39권3호
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• pp.77-81
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• 2015

본 연구에서 배아의 생식세포 동결에 가장 흔히 쓰이고 있는 두 가지 동결 보호제, 즉 DMSO와 EG의 독성을 비교하고자 생쥐 수정란 모델을 이용한 실험을 하였다. 생후 6주령의 암컷 생쥐 $F_1$ hybrid mice에 10 IU의 PMSG를 복강 주사하여 과배란을 유도하고, 2-세포기 배아를 획득하고 DMSO와 EG 각각 노출시킨 후, 배양을 하였다. 배반포의 전체 세포수는 2-세포기 단계에서 DMSO($68.1{\pm}24.1$)로 EG($81.2{\pm}27.0$) 혹은 control($99.0{\pm}18.3$)(p<0.001) 처리구에 비해서 유의적으로 낮았다. DMSO 처리구가 EG 처리구에 비해 세포수가 적었다. DMSO($15.4{\pm}1.5$)와 EG($10.2{\pm}1.4$) 두 처리구는 대조구($6.1{\pm}0.9$, p<0.0001)와 비교해서 배반포에서 세포사 비율이 더 높음을 확인했다. 또한, DMSO 처리구는 EG 처리구(p<0.001)보다 더 많은 세포사멸된 세포가 확인되었다. DMSO 또는 EG 처리군과 대조군 사이에는 배아 부화율에 있어서 차이가 있었으며, 이는 배아에 대한 동결 보호제의 잠재적인 독성을 확인한 결과였다. 이번 연구에서 장기간 처리했을 때 EG 처리군보다 DMSO 처리군에서 배아발달과 세포수가 저하된 것은 DMSO의 독성이 더 높을 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제25권12호
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• pp.1415-1424
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• 2015

본 실험에서는 ICI 182, 780(ICI)을 사춘기의 생쥐에 투여하여 에스트로겐 수용체를 저해시켰을 때 수컷 생식계에 나타나는 변화를 관찰하였다. 더불어 해당 조직학적 변화가 시간이 지남에 따라 자연적으로 회복되는지 여부를 알아보기 위해 150일, 300일동안 회복시키는 실험군을 추가로 설정하여 관찰하였다. 그 결과, 가장 처음 희생한 실험군에서는 ICI의 투여에 따른 형태적 변화가 관찰되었다. 정소에서는 세정관과 생식상피의 위축이 관찰되었다. 더불어 세정관의 단면에서 측정한 세르톨리 세포의 개수가 줄어드는 것이 관찰되었다. 부정소의 initial segment(IS) 부분과 꼬리 부위의 상피세포 높이 또한 변화하였다. IS 부분은 상피세포의 평균 높이가 증가하였고, 꼬리 부위는 상피세포의 평균 높이가 감소하였다. 투여군 수출소관의 경우, 상피세포의 평균 높이가 감소하였고, 내강의 직경이 증가되었다. 투여군 전립샘과 정낭의 경우, 상피세포의 평균 높이가 증가하였다. 정낭의 경우 상피세포의 높이 외에는 특별한 형태적 변화가 나타나지 않았으나, 전립샘의 경우 상피세포의 자유표면 쪽이 반듯한 선을 그리지 않고 흐트러진 형태를 보였다. 앞의 조직학적 변화는 150일간 회복기간을 둔 경우에 투여군이 대조군과 비슷한 수준으로 회복되었다. 150일째 희생시킨 그룹에서 회복되지 않은 조직학적 차이도 있었으나, 이는 300일째 희생시킨 그룹에서는 회복되는 것이 관찰되었다. 이 들 결과를 종합해 보면 ICI 투여는 사춘기 수컷의 생식기관에 조직학적 변화를 유발하였으나, 그 변화는 시간이 지남에 따라 자연스럽게 회복되었다.

• 대한한의학방제학회지
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• 제29권2호
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• pp.71-80
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• 2021

Objectives : This study investigated cellular-protective effects of Nardotidis seu Sulculii Concha water extract (NSCE) against oxidative stress induced by arachidonic acid (AA)+iron or tert-butylhydroperoxide (tBHP). Methods : In vitro, MTT assay was assessed for cell viability, and immunoblotting analysis was performed to detect expression of AMP-activated kinase (AMPK) signaling pathway and autophagy related proteins. In vivo, mice were orally administrated with the aqueous extract of NSCE of 500 mg/kg for 3 days, and then injected with CCl₄ 0.5 mg/kg body weight to induce acute damage. The level of liver damage was measured by serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and lactate dehydrogenase (LDH) analysis. Results : Treatment with NSCE inhibited cell death induced by AA+iron and tBHP. NSCE induced the phosphorylation of AMPK, and this compound also induced the phosphorylation of LKB1, an upstream kinase of AMPK, and Acetyl-CoA carboxylase (ACC), a primary downstream target of AMPK. NSCE increased the protein levels of autophagic markers (LC3II and beclin-1) and decreased the phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) and simultaneously increased the phosphorylation of unc-51-like kinase-1 (ULK-1) in time-dependent manner. Conclusions : NSCE has the ability 1) to protect cells against oxidative stress induced by AA+iron or tBHP. NSCE 2) to activate AMP-activated protein kinase (AMPK), and 3) to regulate autophagy, an important regulator in cell survival.

• 한국수정란이식학회지
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• 제29권3호
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• pp.241-248
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• 2014

본 연구에서 생쥐 초기 배아를 이용하여 동결 보존된 배아의 생존율 또는 발달율에 영향을 미치는 요인들의 상관관계를 알아본 결과, 배아의 발달 단계에 따른 동결 - 해동 후 생존율에 있어서는 2세포기 배아가 4~8세포기 배아보다 유의하게 높았으나(p<0.01), 배 발달율에 있어서는 4~8세포기 배아가 유의하게(p<0.01), 높아 생존율과 배 발달율과는 상관관계가 없는 것으로 사료된다. 또한, 동결 보호제에 따른 배아의 생존율에 있어서는 2, 4~8세포기 배아 모두 DMSO에서 유의하게 높았으나(p<0.01), 배 발달율에 있어서는 EG가 DMSO에 비해 더 유의하게 높은 성적을 나타내어(p<0.01, p<0.05) 동해로 인한 상해가 적은 것으로 생각되어 2, 4~8세포기 배아에서 EG가 더 효과적인 동결 보호제로 사료되며, 동결 프로그램으로는 완만 동결 - 급속 해동법이 더 우수한 프로그램으로 보인다.

• 생명과학회지
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• 제17권2호통권82호
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• pp.198-203
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• 2007

형질전환은 유전자의 기능을 이해하는데 매우 중요한 기법이다. $Ca^{2+}$-인산 침전법은 시간과 비용이 저렴하여 가장 흔히 사용된다. 그러나 성숙 신경세포는 어린 신경세포나 다른 세포종에 비하여 형질전환이 어렵고 쉽게 죽는다. 본 연구에서는 Clontech사의 $CalPhos^{TM}$ Mammalian Transfection 방법을 수정하여 성숙한 신경세포를 효율적으로 형질전환할 수 있는 방법을 고안하였다. 대뇌 신경교세포를 DMEM/10% 말혈청에서 70-80% confluence까지 키우고 배지를 혈청이 첨가되지 않은 Neurobasal/Ara-C로 바꾸어 주어 더 이상 신경교세포가 분열하지 않게 한 다음, 여기에 E19 해마신경세포를 접종하여 배양하였다. $DNA/Ca^{2+}$-인산 침전물은 Clontech사의 $CalPhos^{TM}$ Mammalian Transfection Kit을 이용하여 크기($0.5-1\;{\mu}m$ in diameter) 및 농도(약 10 particles/$100\;{\mu}m^2$)를 배지에서 배양시간을 변화시켜 적당히 조절하였다. 이렇게 하면 in vitro에서 2주 이상 배양한 신경세포도 24-well plate 한 well당 10-15개의 형질전환된 건강한 신경세포를 얻을 수 있었다. 이 방법의 효용성을 검증하기 위하여 연접단백질인 $EGFP-CaMKII{\alpha}$ 융합단백질과 RFP 단백질 유전자(각각 $pEGFP-CaMKII{\alpha}$ 및 pDsRed2)를 형질전환한 결과 전자는 점박이 모양, 후자는 세포전체에 퍼진 양상의 표현을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 연구는 성숙한 신경세포를 효율적으로 형질전환할 수 있는 방법을 제공한다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제44권4호
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• pp.592-601
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• 2015

복분자 와인의 제조를 위하여 복분자 과실 및 엑기스로부터 야생효모 Saccharomyces cerevisiae BA29를 분리 및 동정하였으며, 생화학적 특성 및 biogenic amine 생성 여부, 배양학적 특성 및 알코올 발효능과 알코올, 당, 아황산 저항성을 조사하였다. 또한 S. cerevisiae BA29의 산업적 공정 적용을 위한 균체량 증가를 위하여 통계학적 방법인 반응표면분석법을 사용하여 배양 배지 조성의 최적화를 수행하였다. 실험계획법은 중심합성계획을 사용하여 모델을 설정하였고, 산업적 공정 적용 시 비용 대비 효율성이 높은 molasses를 대체 탄소원으로 사용하여 실험을 수행하였다. 통계프로그램을 이용하여 분석한 결과 최대 균체 성장을 위한 배지 조성으로는 molasses 200 g/L, peptone 30 g/L, yeast extract 40 g/L로 예측되었으며, 이때의 최대 균체량은 20.6565 g/L로 예측되었다. 모델의 검증실험 결과 기본 배양 배지와 비교하였을 때 6.39 g/L에서 $20.9167{\pm}0.7925g/L$로 약 3.27배 증가하였다. 최종적으로 S. cerevisiae BA29를 사용하여 복분자 와인을 제조한 결과 20.33%의 알코올 생성능을 나타냈다. 이로써 복분자 과실로부터 분리한 효모 S. cerevisiae BA29를 이용한 우수한 복분자 와인 제조의 가능성을 확인하였다.