• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제5권1호
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• pp.1-6
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• 2000

For the rapid selection of higher recombinant hirudin producing strain in a methylotrophic yeast Hansenula polymorpha, a multiple gene integration and dose-dependent selection vector, based on a telomere-associated ARS and a bacterial aminoglycoside 3-phosphotransferase (aph) gene, was adopted. Two hirudin expression cassettes (HV1 and HV2) were constructed using the MOX promoter of H. polymorpha and the mating factor $\alpha$ secretion signal of S. cerevisiae. Multiple integrants of a transforming vector containing hirudin expression cassettes were easily selected by using an antibiotic, G418. Hirudin expression level and integrated plasmid copy number of the tested transformants increased with increasing the concentration of G418 used for selection. The expression level of HV1 was consistently higher than that of HV2 under the similar conditions, suggesting that the gene context might be quite important for the high-level gene expression in H. polymorpha. The highest hirudin producing strain selected in this study produced over 96 mg/L of biologically active hirudin in a 500-mL flask and 165 mg/L in a 5-L fermentor.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권12호
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• pp.1949-1954
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• 2007

A simple way to prevent protein hyperglycosylation in Hansenula polymorpha was found. When glucose oxidase from Aspergillus niger and carboxymethyl cellulase from Bacillus subtilis were expressed under the control of an inducible methanol oxidase (MOX) promoter using methanol as a carbon source, hyperglycosylated forms occurred. In contrast, MOX-repressing carbon sources (e.g., glucose, sorbitol, and glycerol) greatly reduced the extent of hyperglycosylation. Carbon source starvation of the cells also reduced the level of glycosylation, which was reversed to hyperglycosylation by the resumption of cell growth. It was concluded that the proteins expressed under actively growing conditions are produced as hyperglycosylated forms, whereas those under slow or nongrowing conditions are as short-glycosylated forms. The prevention of hyperglycosylation in the Hansenula polymorpha expression system constitutes an additional advantage over the traditional Saccharomyces cerevisiae system in recombinant production of glycosylated proteins.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제3권2호
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• pp.65-72
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• 1993

A heterologous gene expression and secretion system using a methylotrophic yeast, Hansenula polymorpha was developed for the production of anticoagulant hirudin. Hirudin gene was expressed under the control of a strong and inducible methanol oxidase (MOX or AOX) promoter. The mating factor a pre-pro leader sequence of Saccharomyces cerevisiae was employed for hirudin to be secreted into the extracellular medium. Hirudin expression cassette was introduced into three strains of H. polymorpha, A16, HPBl and DLl which have different genetic backgrounds. This expression cassette was stably integrated into the host chromosomal DNA. Biologically active and mature hirudin was efficiently expressed and secreted into the extracellular medium. About 19 mg/L of hirudin was found in the culture supernatant in the case of a two-copy integrant of the strain HPBl under suboptimal culture conditions.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제22권5호
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• pp.477-484
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• 1994

Using a methylotrophic yeast Hansenula polymorpha, a heterologous gene expression and secretion system was developed for the production of hEGF(human Epidermal Growth Factor) which has been shown to promote epithelial cell proliferation and to inhibit gastric acid secretion. The hEGF gene was chemically synthesized according to the preferred codon usage in H. polymor- pha and expressed under the control of the strong and inducible methanol oxidase(MOX) promoter. The mating factor $\alpha$ pre-pro leader sequence of Saccharomyces cerevisiae was employed for hEGF to be secreted into the extracellular medium. This expression cassette was stably integrated into the host chromosomal DNA. Mature hEGF was efficiently expressed and secreted into the extracel- lular medium. About 24 mg/l of hEGF was detected in the cuture supernatant of a transformant with pA-EGF3 under the suboptimal culture conditions.

• KSBB Journal
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• 제14권4호
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• pp.482-489
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• 1999

As host for the production of eucaryotic heterologous proteins, methylotrophic yeast Pichia pastoris and Hansenula polymorpha are the most highly developed of a small group of alternative yeast species chosen for their perceived advantages. This paper describes the method to enhance the recombinant protein productivity with P. pastoris and H. Plymorpha. In these experiments, the effects of methanol induction timing, induction method, pH, culture temperature and kinds of nitrogen sources on foreign protein production were tested with P. pastoris and compared with H. polymorpha.. In addition, optimum methanol concentration as inducer and the effects of carbon sources on AOX1 or MOX promoter repression and secretion efficiency were also studied in both cases.

• KSBB Journal
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• 제15권2호
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• pp.174-180
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• 2000

본 연구에서는 다른 host cell 에 비하여 여러 가지 장점을 가지고 있는 Methylotrophic yeast 중 Pichia pastoris와 Hans-enula polymorpha의 fed batch 실험을 통하여 유전자 재조합 단백질 발현최적조건을 구하여 각 균주의 유전자 재조합 albumin 발현 최적화 연구를 수행하였다. 글리세롤이 두 균주의 promoter의 AOX 1과 MOX promoter repression에 미치는 영향을 확인한 바 H. polymorpha가 P. pastoris보다 promoter repression이 심함을 알 수 있었다. 두 균주의 promoter를 induction시키는 최적 메탄올 농도는 P. pastoris의 경우 메탄올 8g/L, H. polymorpha의 경우는 13 g/L임을 알 수 있었다. 또한 메탄올에 의한 induction시기는 두 균주 모두 O.D. 4 정도되는 exponential growth stage에서 메탄올을 첨가하는 경우가 초기 세포 성장단계에 메탄올을 첨가한 경우에 비해 약 20% 정도 높아짐을 확인하였다. 두 균주의 재조합 albumin 발현에 미치는 pH의 영향을 조사하였는데, p. pastoris의 경우 pH 5에서 가장 높은 albumin 생산성을 보여 약 300mg/L albumin을 발현하였고, H. polymorpha 의 경우 pH 5와 6에서 최대 약 180 mg/L의 albumin을 발현하였지만 pH 8에서는 이의 절반 수준에 그쳤다. 두 균주의 최적 fed-batch 방법을 확인하는 실험을 수행하였는데 P. pastoris의 경우의 최적 fed-batch 방법은 mixed feeding은 바람직하지 않고 글리세롤 배지를 공급하여 세포를 성장시킨 후 글리세롤 공급을 멈추고 바로 메탄올로 전환하는 방법을 효과적이며, H. polymorpha의 경우 비성장속도 제어를 통한 글리세롤 공급으로부터 메탄올 공급으로의 단계적 전환방법이 균주의 albumin 발현에 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 이 방법을 통하여 두 균주의 고농도 배양 실험을 수행한 결과 P. pastoris의 경우는 O.D. 300에서 약 4.7g albumin/L를 발현하였다. 이와같은 결과를 바탕으로 산업체에서 methlotrophic yeast를 이용한 상업화를 계획함에 있어서 host로서의 균주를 선택할 수 있는 기본 자료를 제공함과 아울러 균주가 선택된 후에 그 균주를 이용한 재조합 단백질 최적화 방법을 제공하여 줄 것으로 생각된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권11호
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• pp.1555-1562
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• 2010

Development of the strain and the fermentation process of Hansenula polymorpha was implemented for the production of ${\gamma}$-linolenic acid ($GLA,\;C18:3{\Delta}^{6,9,12}$), an n-6 polyunsaturated fatty acid (PUFA) that has been reported to possess a number of health benefits. The mutated ${\Delta}^6$-desaturase (S213A) gene of Mucor rouxii was expressed in H. polymorpha under the control of the methanol oxidase (MOX) promoter. Without the utilization of methanol, a high-cell-density culture of the yeast recombinant carrying the ${\Delta}^6$-desaturase gene was then achieved by fed-batch fermentation under glycerol-limited conditions. As a result, high levels of the ${\Delta}^6$-desaturated products, octadecadienoic acid ($C18:2{\Delta}^{6,9}$), GLA, and stearidonic acid ($C18:4{\Delta}^{6,9,12,15}$), were accumulated under the derepression conditions. The GLA production was also optimized by adjusting the specific growth rate. The results show that the specific growth rate affected both the lipid content and the fatty acid composition of the GLA-producing recombinant. Among the various specific growth rates tested, the highest GLA concentration of 697 mg/l was obtained in the culture with a specific growth rate of 0.08 /h. Interestingly, the fatty acid profile of the yeast recombinant bearing the Mucor ${\Delta}^6$-desaturase gene was similar to that of blackcurrant oil, with both containing similar proportions of n-3 and n-6 essential fatty acids.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권1호
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• pp.17-25
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• 2013

메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이 잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로 부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 $Gly_4Ser_1$ linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H. polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 ($GFP_{uv}$)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H. polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다. 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에 따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비 발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질 분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 시스템은 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현 융합단편의 선별 및 과발현 시스템 구축에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.