A lipopolysaccharide (LPS) defective mutant of Bradyrhizobium japonicum was characterized in terms of its cell surface hydrophobicity (CSH). By monitoring the kinetics of adhesion to hexadecane the LPS mutant was found to be far more hydrophobic than the wild type strain; the removal coefficients were 4.65 $min^{-1}$ for the mutant, as compared with only 2.40 $min^{-1}$ for the wild type. The possible role of cell surface hydrophobicity of B. japonicum in nodulation process is discussed.
Bacterial cell surface components are the major factors responsible for pathogenesis and bioremediation. In particular, the surface of a Gram-negative bacterium cell has a variety of components compared to that of a Gram-positive cell. In our previous study, we isolated an isogenic mutant of Bradyrhizobium japonicum, which exhibited altered cell surface characteristics, including an increased hydrophobicity. Polyacrylamide gel electrophoretic analysis of the lipopolysaccharide (LPS) in the mutant demonstrated that the O-polysaccharide part was completely absent. Meanwhile, a gel permeation chromatographic analysis of the exopolysaccharide (EPS) in the mutant demonstrated that it was unaltered. Since LPSs are known to have several anion groups that interact with various cation groups and metal ions, the mutant provided an opportunity to examine the direct role of LPS in metal binding by B. japonicum. Using atomic absorption spectrophotometry, it was clearly demonstrated that LPS was involved in metal binding. The binding capacity of the LPS mutant to various metal ions $(Cd^{2+},\;Cu^{2+},\;Pb^{2+},\;and\;Zn^{2+})$ was 50-70% lower than that of the wild-type strain. Also, through an EPS analysis and desorption experiment, it was found that EPS and centrifugal force had no effect on the metal binding. Accordingly, it would appear that LPS molecules on B. japonicum effect the properties, which precipitate more distinctly metal-rich mineral phase.
In previous studies, we isolated an isogenic LPS mutant of Bradyrhizobium japonicum 61A101C, which was completely devoid of O-polysaccharide and had altered cell surface characteristics. Subsequently, the mutated gene was identified, cloned, and used to complement the LPS mutant strain JS314 to restore the phenotype. Since it has been reported that in Escherichia coli LPS O-polysaccharide is involved in resistance to an organic acid such as acetic acid under low pH (Barna et al., Molecular Microbiology 43: 629-640, 2002), we compared the organic acid resistance of the three B. japonicum strains; wild-type 61A101C, the LPS mutant JS314, and the complemented strain to determine whether the role of O-polysaccharide in the resistance to organic acid could be generalized. Growth of all three strains was inhibited by the presence of 3 mM acetic acid under acidic condition (pH 5.5). To our surprise, however, in the presence of 2 mM acetic acid, wild-type and the complemented strains did not grow while the $LPS^-$ mutant showed a significant growth. Therefore, unlike in E. coli, the lack of Opolysaccharide of LPS appears to render B. japonicum more resistant to organic acid.
The antibacterial mechanism of enterobacter Salmonella typhimurium was studied. The rfa (Waa) gene cluster of S. typhimurium encodes the core oligosaccharide biosynthesis of lipopolysaccharide (LPS). Among the rfa gene cluster, we recently cloned the rfaE gene, which is involved in ADP-L-glycero-D-manno-heptose biosynthesis. The rfaE mutant synthesizes heptose-deficient LPS, which consists of only lipid A and 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid (KDO), thus making an incomplete LPS and a rough phenotype mutant. S. typhimurium deep-rough mutants with the heptose region of the inner core show a reduced growth rate, sensitivity to high temperature, and hypersensitivity to hydrophobic antibiotics such as baicalin isolated from the medicinal herb of Scutellaria baicalensis Georgi. Thus, in this study, the cloned rfaE gene was added to the S. typhimurium rfaE mutant strain SL1102 (rfaE543), which makes heptose-deficient LPS and has a deep-rough phenotype. The complementation created a smooth phenotype in the SL1102 strain. The sensitivity of SL1102 to bacteriophages was also recovered to that of wild-type strain, indicating that LPS is used as the receptor for bacteriophage infection. The permeability barrier of SL1102 to hydrophobic antibiotics such as novobiocin and baicalin was restored to that of the wild-type, suggesting that antibiotic resistance of the wild-type strain is highly correlated with their LPS. Through an agar diffusion assay, the growth-inhibition activity of baicalin was fully observed in the mutant SL1102 strain. However, only a half of the inhibitory activity was detected in the rfaE complemented SL1102 strain. Furthermore, the LPS produced by the rfaE-complemented SL1102 strain was indistinguishable from LPS biosynthesis of smooth strains.
Bacteriophages infecting Acidovorax citrulli, the causal agent of bacterial fruit blotch, have been proven to be effective for the prevention and control of this disease. However, the occurrence of bacteriophage-resistant bacteria is one of hurdles in phage biocontrol and the understanding of phage resistance in this bacterium is an essential step. In this study, we aim to investigate possible phage resistance of A. citrulli and relationship between phage resistance and pathogenicity, and to isolate and characterize the genes involved in these phenomena. A phage-resistant and less-virulent mutant named as AC-17-G1 was isolated among 3,264 A. citrulli Tn5 mutants through serial spot assays and plaque assays followed by pathogenicity test using seed coating method. The mutant has the integrated Tn5 in the middle of a cupin protein gene. This mutant recovered its pathogenicity and phage sensitivity by complementation with corresponding wild-type gene. Site-directed mutation of this gene from wild-type by CRISPR/Cas9 system resulted in the loss of pathogenicity and acquisition of phage resistance. The growth of AC-17-G1 in King's B medium was much less than the wild-type, but the growth turned into normal in the medium supplemented with D-mannose 6-phosphate or D-fructose 6-phosphate indicating the cupin protein functions as a phosphomannos isomerase. Sodium dodecyl sulfa analysis of lipopolysaccharide (LPS) extracted from the mutant was smaller than that from wild-type. All these data suggest that the cupin protein is a phosphomannos isomerase involved in LPS synthesis, and LPS is an important determinant of pathogenicity and phage susceptibility of A. citrulli.
Hanna, Dams-Kozlowska;Mercaldi, Michael P.;Ramjeawan, Aruranie;Kaplanl, David L
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제18권12호
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pp.1890-1894
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2008
Apoemulsan is a biopolymer with potent emulsification activity, produced by Acinetobacter venetian us RAG-1 (RAG-1). The wee gene cluster is responsible for apoemulsan biosynthesis. The analysis of (i) a putative polysaccharide copolymerase mutant (${\Delta}wzc$), (ii) a putative polymerase mutant (${\Delta}wzy$), and (iii) an apoemulsan-deficient variant (${\Delta}2$) indicated that the wee gene cluster controls the synthesis of two polysaccharides: high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW). LMW polysaccharide of wee origin was present in LPS isolated from RAG-1 cells, suggesting a link to the Lipid A-core of LPS molecules. SDS-PAGE analysis indicated that apoemulsan is copurified with LPS polysaccharide, with implications in the emulsification activity of RAG-1 polymer.
수해양성 병원성 미생물로 알려진 Vibrio anguillarum으로부터 mannose-1-phosphate를 mannose-6-phosphate, glucose-1-phosphate를 glucose-6-phosphate로 가역적으로 변환시키는 phosphomannomutase/phosphoglucomutase (pmm/pgm)의 유전자를 sequencing하여 1338 bp의 open reading frame (ORF)을 밝혔다. 이는 446개의 아미노산을 포함하며 47,625 Da을 가지고 있다. 보고된 다른 Vibrio sp.의 pmm/pgm 유전자와 상동성을 비교하였을 때 V. mimicus V. vulnificus, V. splendidus, V. harveyi와 92.3%, 91.4%, 89.9%, 89.9%에 해당하는 상동성을 지니고 있었다. 증폭된 목적 유전자를 pET-28a(+) vector에 연결하여 대장균에서 단백질의 대량발현을 유도하였으며 이는 주로 soluble한 상태로 나왔다. Soluble fraction을 Ni-NTA column chromatography로 정제하여 약 50 kDa의 단백질을 얻었고 이는 주로 mannose-1-phosphate를 이용하는 효소로 확인되었으며 Mg2+ 이온이 존재할 때 효소의 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구의 유전자는 낮은 온도의 stress하에서 발현이 증가됨을 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)을 통해 확인하였고, 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의한 돌연변이 균주 제작을 통해 PMM/PGM protein과 lipopolysaccharide (LPS)의 생합성과의 관계를 규명하였다. V. anguillarum wild type과 mutant로부터 LPS를 분리하였고 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)후 silver staining을 통해 LPS의 high molecular weight (HMW) 부분인 O-antigen에서의 변화를 확인하였다. 또한 V. anguillarum wild type과 mutant의 growth와 viability를 확인한 결과 mutant가 wild type보다 정지기까지 더 낮은 생육을 보였으며 viability가 감소함을 확인하였다. 본 연구를 통하여 V. anguillarum의 pmm/pgm 유전자가 미생물의 생육과 LPS 생합성에 관여하고 있음을 알 수 있었다.
The lipopolysaccharide (LPS) composed of lipid A, core, and O-antigen is the fundamental constituent of the outer membrane in gram-negative bacteria. This study was conducted to investigate the roles of LPS in Burkholderia glumae, the phytopathogen causing bacterial panicle blight and seedling rot in rice. To study the roles of the core oligosaccharide (OS) and the O-antigen region, mutant strains targeting the waaC and the wbiFGHI genes were generated. The LPS profile was greatly affected by disruption of the waaC gene and slight reductions were observed in the O-antigen region following wbiFGHI deletions. The results indicated that disruption in the core OS biosynthesis-related gene, waaC, was associated with increased sensitivity to environmental stress conditions including acidic, osmotic, saline, and detergent stress, and to polymyxin B. Moreover, significant impairment in the swimming and swarming motility and attenuation of bacterial virulence to rice were also observed in the waaC-defective mutant. The motility and virulence of O-antigen mutants defective in any gene of the wbiFGHI operon, were not significantly different from the wild-type except in slight decrease in swimming and swarming motility with wbiH deletion. Altogether, the results of present study indicated that the LPS, particularly the core OS region, is required for tolerance to environmental stress and full virulence in B. glumae. To our knowledge, this is the first functional study of LPS in a plant pathogenic Burkholderia sp. and presents a step forward toward full understanding of B. glumae pathogenesis.
Resveratrol, a phytoalexin, is reported to activate AMP-activated protein kinase (AMPK) in vascular cells. The blood-brain barrier (BBB), formed by specialized brain endothelial cells that are interconnected by tight junctions, strictly regulates paracellular permeability to maintain an optimal extracellular environment for brain homeostasis. The aim of this study was to elucidate the effects of resveratrol and the role of AMPK in BBB dysfunction induced by lipopolysaccharide (LPS). Exposure of human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) to LPS ($1{\mu}g/ml$) for 4 to 24 hours week dramatically increased the permeability of the BBB in parallel with lowered expression levels of occluding and claudin-5, which are essential to maintain tight junctions in HBMECs. In addition, LPS significantly increased the reactive oxygen species (ROS) productions. All effects induced by LPS in HBVMCs were reversed by adenoviral overexpression of superoxide dismutase, inhibition of NAD(P) H oxidase by apocynin or gain-function of AMPK by adenoviral overexpression of constitutively active mutant (AMPK-CA) or by resveratrol. Finally, upregulation of AMPK by either AMPK-CA or resveratrol abolished the levels of LPS-enhanced NAD(P)H oxidase subunits protein expressions. We conclude that AMPK activation by resveratrol improves the integrity of the BBB disrupted by LPS through suppressing the induction of NAD(P)H oxidase-derived ROS in HBMECs.
Kim, Yong Chan;Song, Seok Bean;Lee, Sang Kyu;Park, Sang Min;Kim, Young Sang
IMMUNE NETWORK
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제14권2호
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pp.116-122
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2014
Macrophage death plays a role in several physiological and inflammatory pathologies such as sepsis and arthritis. In our previous work, we showed that simvastatin triggers cell death in LPS-activated RAW 264.7 mouse macrophage cells through both caspase-dependent and independent apoptotic pathways. Here, we show that the nuclear orphan receptor NR4A1 is involved in a caspase-independent apoptotic process induced by LPS and simvastatin. Simvastatin-induced NR4A1 expression in RAW 264.7 macrophages and ectopic expression of a dominant-negative mutant form of NR4A1 effectively suppressed both DNA fragmentation and the disruption of mitochondrial membrane potential (MMP) during LPS- and simvastatin-induced apoptosis. Furthermore, apoptosis was accompanied by Bcl-2-associated X protein (Bax) translocation to the mitochondria. Our findings suggest that NR4A1 expression and mitochondrial translocation of Bax are related to simvastatin-induced apoptosis in LPS-activated RAW 264.7 macrophages.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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