• 제목/요약/키워드: Ion-chromatography

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Bacillus stearothermophilus Peptidyl Prolyl cis-trans Isomerase의 정제 및 유전자 분석 (Purification and Gene Analysis of Peptidyl Prolyl cia-trans Isomerase from Bacillus stearothermophilus)

  • 김동주
    • 한국식품영양학회지
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    • 제15권2호
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    • pp.104-111
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    • 2002
  • 호열균 B. stearotheymophilus으로부터 단백질 고차구조 형성을 촉진하는 내열성 PPIase를 정제하기 위해, 이 균체를 대량으로 배양 집균, 파쇄하여 효소활성을 측정하였다. 효소의 활성측정은 N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pAN)를 기질로 사용하였다. chymotrypsin은 기질 이성체(cis-trans 형)의 한쪽(trans)만을 특이적으로 분해하는 반응을 이용하여 PPIase 활성을 측정하였다. 호열균 추출시료로 부터 효소활성을 확인한 후, DEAE-sepharose CL-6B, Sephadex G-75로 정제 후, 최종적으로 Superose TM-12 (FPLC) gel-필트레이션으로 분자량 18kDa의 본 효소를 정제하였다. 정제한 효소의 화학적 특징을 조사한 결과 pH 7.5~8.0사이에 안정하였으며, 최적 pH는 8.0으로 나타났다. 그리고 $65^{\circ}C$에 30분간 열처리 후, 효소활성을 측정한 결과 50%이상의 잔존 활성을 갖는 내열성 효소임을 확인하였다. 정제 단백질의 N-말단 아미노산 분석은 Edman 분해법으로 39 아미노산 잔기를 결정하였다. 그리고 PPIase의 재구성(refolding) 반응은, 요소로 변성시킨 기질 RNase 1을 이용하여 이 단백질의 재구성 (refolding) 실험을 조사한 결과, PPIase는 변성 기질 RNase 1의 재구성(refolding)을 촉진하는데 높은 효과를 가지고 있었다. 호열균 유전자 라이브러리로부터 PPIase 유전자 약 3kb을 클로닝하였다. 재조합 플라스미드 cPI-40에서 프라이머(A-1, B-2)를 이용하여 PPIase N-말단을 코드하는 유전자를 PCR법으로 증폭하여, 염기배열을 결정한 결과 증폭된 단편은 165염기로 형성된 55 아미노산 잔기를 코드하는 open reading frame(ORF)가 연속되고 있었다. 그리고 Edman법으로 결정한 PPIase의 39아미노산 잔기가 이 배열내에 완전히 보존되어 있었다. 이 결과로부터 이 ORF는PPIase구조 유전자의 1/3에 해당하는 단편임을 확인하였다.

알긴산 분해균 Bacillus licheniformis AL-577가 생산하는 균체외 효소의 정제 및 특성 (Purification and Characterization of the Extracellular Alginase Produced by Bacillus licheniformis AL-577)

  • 어명희;주동식;조순영;민태선
    • 한국식품영양과학회지
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    • 제35권2호
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    • pp.231-237
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    • 2006
  • 알긴산을 선택적으로 분해하는 Bacillus licheniformis AL-577 균주가 생산하는 균체 외 효소를 정제하고 특성을 밝혔다. CM-Cellulose, DEAE-Sepharose 및 Gel 크로마토 그래프 등의 순서대로 정제하여 정제도가 약 98배 정도인 효소를 얻었다. 정제효소의 활성 최적 pH 및 온도는 5.0 및 $35^{\circ}C$이었고, pH 5.5이하와 pH 9.5이상의 반응조건에서는 불안정하였으며, $20^{\circ}C$이상의 온도에서는 불활성화가 쉽게 일어나는 효소였다. 얻어진 효소를 SDS-PAGE로 분자량을 측정한 결과 25,500 Da으로 추정되었다. NaCl 0.2 M 농도에서 최대의 활성을 나타내었고, 무첨가시에도 활성은 약간 나타내었다. $Cu^{2+},\;Fe^{2+},\;Mg^{2+},\;Zn^{2+}$ 등과 같은 2가 금속이 온에 의해서는 활성이 현저히 억제되었고, $K^+,\;Li^+$ 이온에 의해서 활성이 촉진됨을 알 수 있었다. 화학약품인 dithiothreitol 와 O-phenanthroline의 첨가로 인하여 약간의 활성 증가를 가져 왔으며 반면 EDTA, L-cysteine는 현저하게 감소하였다. 이 효소는 알긴산에만 특이적으로 작용함으로써 본 효소는 alginase 또는 alginate lyase인 것으로 판단되었다.

GC/MS-SIM을 이용한 우리나라 수중 생물시료 중 알킬페놀, 클로로페놀과 비스페놀 A의 분석을 위한 냉동필터법의 응용 (Application of Freezing Filtration Method to the Analysis of Alkylphenols, Chlorophenols and Bisphenol a in Korean Aquatic Biological Samples Using GC/MS-SIM)

  • 김협;장철현
    • 대한환경공학회지
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    • 제29권6호
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    • pp.689-698
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    • 2007
  • 우리나라 수중 생물시료에 있는 알킬페놀류, 클로로페놀류 및 비스페놀 A의 정량분석을 위한 새로운 기술을 제시하였다. 우리나라 수중 생물시료에 있는 알킬페놀류, 클로로페놀류 및 비스페놀 A를 아세토니트릴로 추출한 다음 아세토니트릴 층을 2 시간동안 $-60^{\circ}C$에 냉동하였다(냉동필터). 또한, XAD-4를 이용한 고체상 추출 후, isobutoxycarbonyl(isoBOC) 또는 tert-butyldimethylsilyl(TBDMS) 유도체화 한 후 가스크로마토그래피/질량분석기-선택이온 모니터링 방법을 사용하였다. isoBOC 유도체화와 TBDMS 유도체화의 회수율은 $70.1\sim150.6%$$93.8\sim108.3%$이였으며, 선태이온 모니터링 방법을 이용한 비스페놀 A의 분석방법 검출한계는(MDLs) 각각 $0.062{\mu}g/kg$$0.010{\mu}g/kg$이었다 이 방법을 우리나라 수중 생물시료에 적용하였을 때, 11가지 페놀성 내분비계장애물질의 농도는 $0.675\sim1.970{\mu}g/kg$이었다.

군산지역 부유분진의 계절적 농도변화와 화학적 조성에 대한 연구 (Chemical Compositions Trends of Airbone PArticles at Kunsan)

  • 오진만;김득수
    • 한국대기환경학회지
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    • 제17권6호
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    • pp.475-485
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    • 2001
  • The presence of airborne particles in the earth atmosphere expert important controls on the global climate because of their effects on the radiative balance. However, there are major uncertainties associated with the direct and indirect radiative effects of aerosols. In addition, their physicochemical properties cannot only the decline of air quality but also damage human health. Airborne particles were collected by two different commercial air samples, high volume sampler(for TSP) and low volume sampler(for P $M_{10}$ ) at the campus of Kunsan National University during February to September, 2000. In most cases, TSP and P $M_{10}$ were sampled once a week for the duration of 24 hours from 9:00 a.m. In addition samples were collected more intenisve, when the yellow dust was expected. Each sample was analyzed for pH and major ions concentration (C $l^{[-10]}$ , S $O_4$$^{2-}$, N $O_3$$^{[-10]}$ , N $a^{+}$, N $H_4$$^{+}$, $K^{+}$, $Mg^{2+}$, $Ca^{2+}$) by ion chromatography and atomic absorption spectrophotometry. Acidity (pH) of TSP and P $M_{10}$ ranged from 5.09 to 8.51 and from 6.22 to 7.54, respectively. The concentrations of airborne particles were found to satisfy both the short and long-term air quality standards during the sampling period. If the ratio of ionic concentrations originating from None sea salt(Nss) to sea salt(ss) in aerosol samples was concerned, it was found that the ionic concentrations from marine environment contributed dominantly in total mass concentration in the airborne particles. When seasonal trends were examined, the TSP concentrations in spring were higher than those of other seasons. It may result form frequent occurrences of yellow dust and during the spring season. The concentration ratio of P $M_{10}$ to TSP ranged from 0.78 to 1 during the sampling period. pH in the airborne particle was highest during spring, but the other seasons maintained almost same level. These results suggest that alkaline species in yellow dust can directly neutralize aerosol acidity. During spring season, yellow dust could be a positive factor that can defer the acidification of surface soil and water by neutralizing acidic aerosols in the atmosphere.osphere.

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세균에 의한 생전분 분해효소의 생성 및 특성 (Production and Characterization of Raw Starch Hydrolyzing Enzyme from Bacteria)

  • 박인식;남인;고선옥;김기남;서경순
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제18권3호
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    • pp.244-250
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    • 1990
  • 토양으로부터 생전분을 분해하는 세균을 분리하였으며, Bacillus sp.로 동정하였다. 분리한 세균으로부터 생전분 분해효소의 생성을 위한 최적조건을 검토하였다. 세균은 탄소원으로 wheat 및 soluble starch를, 질소원으로 polypeptone을 사용했을 때 최대 효소생성을 얻을 수 있었다. 그리고 탄소원을 0.5, 질소원을 0.5 수준으로 사용했을 때 효소 생성을 극대화 하였다. 그리고 배지의 초기 pH를 6.5, 배양온도를 $35^{\circ}C$로 유지했을 때 효소생성이 높았다. Seepharose CL-6B 젤 여과 및 DEAE-Sephacel 이온교환수지를 사용하여 부분정제한 효소활성의 최적조건은 pH6.5, 온도 $70^{\circ}C$ 였다.

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Aerobic Degradation of Tetrachloroethylene(PCE) by Pseudomonas stutzeri OX1

  • Ryoo, Doohyun;Shim, Hojae;Barbieri, Paola;Wood, Thomas K.
    • 한국지하수토양환경학회:학술대회논문집
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    • 한국지하수토양환경학회 2000년도 추계학술대회
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    • pp.207-208
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    • 2000
  • Since trichloroethylene (TCE), dichloroethylene (DCE), and vinyl chloride (VC) arise from anaerobic degradation of tetrachloroethylene (PCE) and TCE, there is interest in creating aerobic remediation systems that avoid the highly toxic VC and cis-DCE which predonominate in anaerobic degradation. However, it seemed TCE could not be degraded aerobically without an inducing compound (which also competitively inhibits TCE degradation). It has been shown that TCE induces expression of both the toluene dioxygenase of p. putida F1 as well as toluene-p-monooxygenase of P.mendocina KRI. We investigated here the ability of PCE, TCE, and chlorinated phenols to induce toluene-o-xylene monooxygenase (ToMO) from P.stutzeri OX1. ToMO has a relaxed regio-specificity since it hydroxylates toluene in the ortho, meta, and para positions; it also has a broad substrate range as it oxidizes o-xylene, m-xylene, p-xylene, toluene, benzene, ethylbenzene, styrene, and naphthalene; chlorinated compounds including TCE, 1, 1-DCE, cis-DCE, trans-DCE, VC, and chloroform : as well as mixtures of chlorinated aliphatics (Pseudomonas 1999 Maui Meeting). ToMO is a multicomponent enzyme with greatest similarity to the aromatic monooxygenases of Burkholderia pickettii PKO1 and P.mendocina KR1. Using P.sturzeri OX1, it was found that PCE induces P.mendocina KR1 Using P.situtzeri OX1, it was found that PCE induces ToMO activity measured as naphthalene oxygenase activity 2.5-fold, TCE induces 2.3-fold, and toluene induces 3.0 fold. With the mutant P.stutzeri M1 which does not express ToMO, it was also found there was no naphthalene oxygenate activity induced by PCE and TCE; hence, PCE and TCE induce the tow path. Using P.putida PaW340(pPP4062, pFP3028) which has the tow promoter fused to the reporter catechol-2, 3-dioxygenase and the regulator gene touR, it was determined that the tow promoter was induced 5.7-, 7.1-, and 5.2-fold for 2-, 3-, 4-chlorophenol, respectively (cf. 8.9-fold induction with o-cresol) : however, TCE and PCE did not directly induce the tou path. Gas chromatography and chloride ion analysis also showed that TCE induced ToMO expression in P.stutzeri OX1 and was degraded and mineralized. This is the first report of significant PCE induction of any enzyme as well as the first report of chlorinated compound induction of the tou operon. The results indicate TCE and chlorinated phenols can be degraded by P.stutzeri OX1 without a separate inducer of the tou pathway and without competitive inhibition.

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(β-lactam계 항생물질 저항성을 지닌 Bacillus sp. J105 균주로부터 분비되는 베타 락탐 분해효소의 정제 및 특성 (Purification and Characterization of β-Lactamase Secreted from Bacillus sp. J105 Strain having β-Lectam Antibiotics Resistance.)

  • 조경순;강병원;서민정;이영춘;이재헌;주우홍;최영현;임학섭;김정인;서권일;정영기
    • 생명과학회지
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    • 제18권6호
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    • pp.845-851
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    • 2008
  • Bacillus sp. J105 strain으로부터 유도된 ${\beta}-lactamase$는 ammonium sulfate 침전, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과 등의 과정을 거쳐 SDS-PAGE에서 단일 band로 정제하였다. 정제된 효소의 분자량은 31 kDa이었으며 등전점은 7.35이었다. 효소반응의 최적 pH와 온도는 각각 5와 $40^{\circ}C$이었다. 정제 단백질의 총 아미노산 조성의 분석 결과, Gly과 Ala이 각각 14.1과 13.3 mole%로 가장 많은 아미노산 잔기를 차지하고 있었다. 정제 효소의 ampicillin을 기질로 하였을 때의 Km값은 1.33 mM이었고 Vmax값은 0.36 mM/ml이었다.

Halomonas sp. ES 10이 생산하는 alkaline protease의 특성 (Characteristics of the alkaline protease from the moderate halophile, Halomonas sp. ES 10)

  • 김찬조;오만진;최성현
    • Applied Biological Chemistry
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    • 제35권4호
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    • pp.237-241
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    • 1992
  • Halomonas sp. ES 10이 생산하는 protease를 methanol 침전, Sephadex G-150, G-200 및 DEAE-Sephadex A-50으로 여과하여 비활성이 1,014 units/mg protein, 수율이 7%로 정제하였다. 이 효소의 작용 최적온도 및 pH는 $35^{\circ}C$ 와 pH 11.0 이었고, $50^{\circ}C$ 에서 40분에 70%의 잔존활성을 보였으며 $pH\;7.5{\sim}11.0$ 범위에서 안정하였다. 정제효소의 우유 casein에 대한 Km값은 7.4 mg/ml 이었다. $Li^+$, $Ca^{2+}$, SDS, Tween 80 등은 효소 활성을 다소 증가시키고 $Hg^{2+}$과 EDTA는 심히 저해하였다. DFP와 PMSF에 의해서는 각각 63%, 107%의 상대활성을 보여 이 효소는 serine protease가 아님을 시사하였다. 0.5 M과 1 M의 NaCl 농도에서 각각 95%와 65%의 상대활성을 보여 일반 미생물의 protease 보다 각각 20%, 15%씩 상대활성이 높았다.

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Phellinus igniarius로부터 분리한 단백다당류의 분리 및 특성 (Characteristics and purification of proteoglycan from Phellinus igniarius)

  • 김선희;정인창;권용일;김소연;이종숙;이항우;이재성
    • Applied Biological Chemistry
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    • 제43권1호
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    • pp.57-62
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    • 2000
  • Phellinus igniarius의 배양방법별 균사체 및 단백다당류 생산수율비교 실험에서는 균사체내 다당류의 경우 모두 진탕배양이 효과적이었으나 균사체외 다당류의 경우 다당류 생산에서는 정치배양이 효과적이었다. 다당류의 정제는 조단백다당류를 이용하여 DEAE-cellulose column에 의한 1차 정제를 행하였고, 최종으로 Sepharose 2B를 이용한 2차 정제를 실시하여 최종적으로 균사체내 단백다당류의 탈이온수 분획물(PIIPDG)과 알칼리분획물(PIIPAG), 균사체외 단백다당류의 탈이온수 분획물(PIEPDG) 알칼리 분획물(PIEPAG)을 얻었다. 이때의 정제 수율은 1차 정제에서 40%의 회수율을 나타내었으며 2차 정제에서는 $38{\sim}61%$의 높은 회수율을 보였다. PIEPDG는 총당 79.0%, 총단백질 7.2%, PIEPAG는 총당 56.7%, 총단백질 40.8%, PIIPDG는 총당 64.8%, 총단백질 17.4%, PIIPAG는 총당 56.9%, 총단백질 41.5%으로 측정되었다. 각 단백다당류의 분자량은 PIEPDG 166KDa에서 PIEPAG 565KDa까지 모두 10만이 넘는 거대분자로 나타났다. 각 분획물의 단당류 조성을 볼때, PIEPDG는 glucose, PIIPDG와 PIIPAG는 glucose, inositol, PIEPAG는 glucose, rfructose, inositol이 검출되었다.

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Alachlor 처리후(處理後) 귀리 근단(根端)에 존재(存在)하는 동위과산화효소(同位過酸化酵素) 정제(精製) 및 효소(酵素)의 생리적(生理的) 특성(特性) (Purification and Pysiological Characterization of Isoperoxidase from Oat Root Treated with Alachlor)

  • 권성환;한광수;김재철
    • 한국잡초학회지
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    • 제14권1호
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    • pp.56-61
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    • 1994
  • 귀리의 근단(根端) 조직(組織)에 alachlor $1{\times}10^{-4}$ M 처리후(處理後) 음(陽)이온의 과산화(過酸化) 효소(酵素)를 유출(抽出)하여 에탄올과 이온 교환 수지인 DEAE-celluose 및 CM-sephadex를 이용하여 정제(精製)한 결과(結果), 약 30배의 정제율(精製率)을 얻었으며, 3개의 음(陽)이온을 띤 동위(同位) 효소(酵素)가 존재(存在)하였다. 귀리 근단(根端)에 존재(存在)하는 주(主)된 과산화(過酸化) 효소(酵素)(B fraction)는 최종(最終) 정제후(精製後) 전체(全體) 동위과산화(同位過酸化) 효소중(酵素中) 65%를 차지하였으며, 37배로 정제(精製)되었다. SDS-PAGE를 이용하여 B부분을 전개(展開)한 결과(結果), 단일(單一) band를 얻었으며, 이 때 분자량(分子量)은 약 42,500으로 추산(推算)되었다. 기내에서 동위(同位) 과산화(過酸化) 효소(酵素)의 활성(活性)은 IAA에 의하여 감소(減少)되었다. 50unit 동위(同位) 과산화(過酸化) 효소(酵素)를 귀리에 처리시(처리處理時) 무처리구(無處理區)에 비하여 근단(根端)의 세포분제(細胞分製)은 70.2%, 초엽의 세포신장(細胞伸長)은 54.2% 억제(抑制)되는 현상을 보였다.

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