Phytase(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydro-lase;EC 3.1.38)활성은 소화기관인 소장 점막에서나 나타났고, 그 외 다른 장기에서는 alkaline phosphatase활성만을 측정할 수 있었다. 그리고 anti-90kDa phytase항혈청을 이용한 면역조직학적 조사 결과 소장 이외의 장기에서는 본 효소의 단백질 밴드가 검출되지 않았다. 이와 같은 결과 phytase는 소장에만 특이적으로 존재하며, 소장 특이적 효소의 생리적 역할로서 Phytic acid(inositol=hexakisphos-phate)를 가수분해한다. 흰쥐의 성장 발육과 더불어 phytase의 활성은 증가한다. 출생 후부터 이유기 전까지는 70kDa phytase외에도 90kDa phy-tase가 출현한다. 이 90kDa phy-tase는 이유기에 합성되는 것으로 추정된다.
Phytase(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydro-lase;EC 3.1.3.8)는 흰주 소장 점막으로 부터 분리${\cdot}$정제 하였다. 이 정제된 효소를 Sephacryl S-200 gel filtration방법으로 측정한 분자량으니 160kDa이고, 순도 및 이 효소의 서브유니트를 SDS-polycrylamide gel전기영동법(SDS-PAGE)으로 조사한 결과 서브유니트 구조는 분자량이 10kDa와 90kDa으로 구성된 hetrodimer(이종이량체)임을 알 수 있었다. 그리고 $ MgCl_{2}$ 존재 하에서는 효소 활성이 증가하나 $ZnCl_{2}$, $MnCl_{2}$, 및 EDTA존재 하에서는 효소 활성이 저해되었다. 기질 트이성과 pH범위에서 기질인 phytic acid(inositol-hexakispho-sphate)에 대해 높은 친화력을 보였다. Phytic acid에 대한 Km값은 pH 7.4에서 0.31mM이다. 따라서 흰쥐의 소장 점막 phytase는 주로 inositol의 대사계에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
본 연구는 phytic acid를 myo-inositol과 무기태인으로 분해시키는 효소인 phytase 생산균주의 분리 및 효소생산의 배지최적하에 관한 것이다. 1차로 calcium phytate를 기질로 함유한 phytase screening 배지를 이용하여 phytase 생산을 나타내는 균주 35가지를 이용하여 분리한 후, sodium phytate를 기질로 하여 재현성 있는 phytase 활성을 나타내는 균주 12가지를 선발하였다. 12개의 균주 중 BHI broth에서 배양한 조효소액의 phytase 활성이 가장 우수한 것으로 나타난 YH100을 선발하여 주사현미경 관찰, 16S rRNA sequence 분석, GC conten(mol%) 조성, 지방산 분석, API 20E kit를 이용한 test 결과 Enterobacter cloacae로 동정되어, 이 균주를 Enterobacter cloacae YH100이라 명명하였다. Enterobacter cloacae YH100에 의한 phytase 생산을 위한 최적 배지 조성을 파악한 결과 glucose 2.0%(w/v), peptone 1.0%(w/v), beef extract 1.0%(w/v), KCI 0.1%(w/v), sodium phytate 0.1%(w/v)로 나타났다.
Kim, Young-Hoon;Gwon, Moon-Nam;Yang, Si-Yong;Park, Tae-Kyu;Kim, Chan-Gil;Kim, Chang-Won;Song, Min-Dong
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제12권2호
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pp.279-285
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2002
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phospho-hydrolase, EC 3.1.3.8) catalyzes the hydrolysis of phytate (myo-inositol hexakisphosphate) to release inorganic phosphate. A bacterial strain producing phytase was isolated from soil around a cattle shed. To identify the strain, cellular fatty acids profiles, the GC contents, a quinine-type analysis, and physiological test using an API 20NE kit were carried out. The strain was identified to be a genus of Pseudomonas sp. and named as Pseudomonas sp. YH40. The optimum culture condition for the maximum productivity of phytase by Pseudomonas sp. YH40 were attained in a culture medium composed of $1.0\%$ (w/v) glycerol, $2.0\%$ (w/v) peptone, and $0.2\%$ (w/v) $FeSO_4{\cdot}7H_2O$. Within the optimal medium condition, the production of phytase became highest after 10 h of incubation, and the maximal phytase production by Pseudomonas sp. YH40 was observed at $37^{\circ}C$ and pH 6.0.
Phytases are hydrolytic enzymes that catalyze the sequential hydrolysis of phytic acid (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate) to myo-inositols with lower numbers of phosphate groups. Two types of phytases have been identified which initiate hydrolysis of the phytic acid at either the 3- or 6- position of the inositol ring. In the present investigation, a mathematical model was proposed and computed to estimate maximum enzyme reaction rate constants which fit the experimental data obtained by other authors. Although the data points were scattered to some extent, good agreement was found between the model and the experiment data. It appears that the maximum rate constants of removal of the first, second, and third phosphate groups were not equal. Also there was neither a steady trend upward or downward in the rate constants with the stepwise hydrolysis reactions.
Phytic acid (myo-inositol hexaphosphate or IP6) is the major storage form of phosphorus in cereals and legumes, representing 18 to 88% of the total phosphorus. Phytate form of phosphorus is not readily utilized by monogastric animals and this result causes pollution problem by phosporus released in areas of intensive livestock production. The interaction between phytic acid and essential dietary minerals, protein, or vitamins is considered to be one of the primary factors limiting the nutritional values of cereals and legunes in monogastric animals. Attempts have been made to hydrolyze dietary phytic acid by phytases to improve the feed quality and to decrease the amount of phosphorus excreted by animals. Phytase(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) hydrolyzes phytic acid to myo-inositol and phosphoric acid. Two types of phytases are known: 3-phytase (EC 3.1.3.8) and 6-phytase (EC 3.1.3.26), indicating the intial attack to the susceptable phosphoester bond. Because of its great industrial importance, there is ongoing interest in isolating new bacterial strains producing novel and efficient phytases.
Phytases (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase; EC 3.1.3.8) are enzymes which catalyze the hydrolisys of phytate into myo-inositol and inorganic phosphates. Phytases are found in plants and a variety of microorganisms. Aspergillus species were treated with 254 nm of UV irradiation for the screening of phytase overproducing mutant strains. At 15 minute irradiation, the survivals of population were less than 5%, and UV irradiation time was decided at 20 minute for the isolation of mutant strains. Four UV mutant strains in A. oryzae (YUV-47, -169, -341, -511) and six in A. ficuum (FUV-17, -36, -69, -193, -317, -419) were isolated on PSM media containing ammonium phosphate. The specific enzyme activities of A. ficuum mutants are 110 to 140% higher than that of wild type.
Streptomyces coelicolor의 전 유전체 청보를 분석한 결과(7), 유전자 ID1103135가 코드 하는 open reading frame SCO7697이 phytase[myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase상동성 (3-6,8,23)]에 유의하게 유사한 것으로 판단되었다. S. coelicolor A3(2)M의 염색체 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 SCO7697 전체를 포함하는 DNA 단편을 클로닝하였다. 두 가지의 서로 다른 길이를 갖는 클로닝 된 ID1103135 DNA 단편을 E. coli 발현용 벡터pET728a(+)에 삽입하여,두 종의 재조합 벡터 pET28-SP와 pET28-LP를 얻었다. pET28-SP 와 pET28-LP를 각각 E. coli BL2l에 도입하여, IPTG로 발현 유도된 단백질을 SDS-polyacrylamide 전기영동으로 확인한 결과, 발현은 성공적으로 이루어 졌으나 대부분불용체를 형성하고 분자량은 예상보다 약간 큰 것으로 나타났다. 불용체 형성은 단백질의 불활성화를 수반 함으로서, 배양 온도를 $37^{\circ}C$에서 $30^{\circ}C$로 변화시켜 배양하는 방법으로 발현된 단백질을 가용화 시켰다. 발현된 단백질을 추출하여 조추출물 또는 정제한 상태로 phytase활성을 측청하였으나 효소활성은 관찰할 수 없었다. 대장균 시스템에서의 발현이 효소 활성의 소실을 초래했을 가능성이 있으므로, ID1103135 유전자를 자신의 promoter를 함유하도록 PCR 클로닝하여, E. coli - Streptomyces의 shuttle vector인 pWHM3에 삽입하고, 이를 방선균 호스트인 S. lividans에 도입하였다. 형질 전환체의 세포조추출액 및 세포배양액의 phytase 활성을 측청하였으나, 역시 활성을 확인할수 없었다. 이와 같은 결과는 SCO7697이 아주 높은 확률(E value; $6e^{-89}$)로 phytase일 것으로 annotation 되었으나, 실제는 이와는 다른 기능을 함유하고 있음을 시사하고 있다.
CHOI, JAE-MUN;DOO-SANG KIM;MOON-SICK YANG;HYUNG-RAK KIM;JAE-HO KIM
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제11권6호
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pp.1066-1070
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2001
The PhyA gene, encoding myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase in Aspergillus niger var. awamori (wild-type), was cloned and sequenced. The cDNA was overexpressed by a multicopy gene expression system in Pichia pastoris KM71. Recombinant, wild-type and commercial phytase from Aspergilus ficuum NRRL 3135 (Natuphos) were purified. The PhyA gene of Aspergillus niger var awamori showed perfect homology to the phytase of Aspergillus ficcum and $97\%$ homology to A. niger var awamori (L02421). Wild-type phytase was highly glycosylated and more thermostable than the other two, while deglycosylated farms of three phytases showed identical molecular weight, 507 kDa. After heating at $80^{\circ}C$, wild-type, commercial, and recombinant phytases retained $57\%, 32%,\;and\;8\%$ of their original activities, respectively. In conclusion, glycosylation plays a key role in the thermostability of phytase and its enzymatic characterization.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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