• 한국수정란이식학회지
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• 제19권1호
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• pp.43-51
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• 2004

본 연구에서는 체세포를 이용한 돼지 복제수정란의 생산효율을 높이는 최적의 방법을 구명코자 핵이식 수정란에 각기 다른 조건들의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화를 유도하여 융합율, 분할율, 후기배로의 발달율 및 배반포기배의 할구수를 비교ㆍ조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 핵이식 복제 수정란과 전기자극에 의한 단위발생란과의 체외배양후 분할율을 비교한 결과 두 처리간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 배양7일째 배반포기배로의 발달율에 있어서는 복제수정란이 7.6%로 나타나 단위발생란의 20.4%에 비해 낮은 후기배로의 발달율을 나타내었다. 핵이식 수정란의 전기적 융합에 있어서 각기 다른 전기자극의 조건에 따른 융합율과 분할율 그리고 후기배로의 발달율에 있어서 110 V/mm의 전기적 자극이 주어진 군에서는 47.1%로 나타나 130 V/mm의 자극과 150 V/mm의 자극이 주어진 두 군에서의 70.2%와 72.6%에 비해 낮은 융합율을 나타내었고, 분할율에 있어서도 각각 48.6%, 72.6%와 70.5%로 나타나 110 V/mm의 자극이 주어진 군에서 두 처리군보다 낮은 성적을 나타내었다. 그러나 배반포기배로의 발달율에 있어서는 각각의 처리군에 있어서 8.1%, 9.7% 및 10.7%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 체세포를 이용한 핵이식수정란의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화에 있어서 3가지의 각기 다른 처리군(A type, SA 방법; B type, SA 방법과 CB 처리군; C type, DA 방법과 CB 처리군)으로 나누어 조사한 결과 3가지의 처리군에 있어서의 분할율은 각각 71.4%, 74.7% 및 70.8%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 배반포기배로의 발달율에 있어서도 각각 9.7%, 8.0% 및 11.2%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한 배반포기배의 할구수에 있어서도 3가지 처리군에서 각각 22.5$\pm$12.8, 23.3$\pm$11.2 및 21.6$\pm$10.4로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이상의 실험 결과들을 종합해 보면, 본 연구에서는 돼지의 체세포를 이용한 핵이식 수정란의 융합시 130 V/mm 또는 150 V/mm, 50 ${\mu}\textrm{s}$ec, 2 pul-se의 전기적 강도를 이용하고, 활성화 방법으로는 SA 방법 또는 DA 방법을 병행한다면 복제수정란의 생산효율을 향상시킬 수 있음을 시사하였다. 따라서 돼지의 체세포를 이용한 복제수정란의 생산효율을 향상시키기 위해서는 핵이식 수정란의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화에 관한 조건이 확립되어야 하며, 또한 후기배로의 발달율 향상을 위한 최적의 체외배양조건이 확립되어야 할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권2호
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• pp.155-163
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• 2004

본 연구는 도축돈의 난소로부터 난자를 채취하여 체외배양시킨 후 세포 안정제와 원심분리 그리고 OPS를 이용한 유리화동결 하였다. 동결 융해한 수정란을 경산돈에 외과적 또는 비외과적으로 이식하여 자돈을 생산하는 것을 목적으로 수행하였다. ${\cdot}$ 도축돈 난소로부터 채란되어진 돼지 미성숙난은 Funahashi 등(1994) 방법에 따라 체외 성숙-수정-배양하였다. 체외배양액은 glucose-free NCSU 23을 이용하였으며, 5일째에 10% Fatal bovine serum (FBS)을 첨가 배반포로 발달을 유도하였다. ${\cdot}$ 체외배양된 수정란은 7.5${\mu}$g.mL cytochalasin B에 30분 처리 후 13,000 rpm에 13분간 원심 분리하였고, ethylene glycol(EG) 동결액으로 처리한 뒤 OPS를 이용하여 동결${\cdot}$융해하였다. ${\cdot}$ 동결수정란과 비동결수정란을 plastic straw에 loading 한 후 3두에는 경산돈에 외과적 방법으로 각각 100개, 100개의 동결수정란과 대조군으로 34개의 비동결수정란을 이식하였고 다른 3두에는 비외과적 방법으로 각각 150개, 150개의 동결수정란과 대조군으로 100개의 비동결수정란을 각각 이식하였다. 외과적이식돈의 대조군에 사용한 신선수정란은 비경산돈 3두에서 채란하였다. ${\cdot}$이식 결과 6두 모두 지연성 발정을 보였으며 이중 동결수정란 이식돈은 임상적으로 정상이였으나 비동결수정란은 이식한 경우는 자궁내막염과 복강탈장이 관찰되었다. 주요 원인은 시술시 기술의 미숙과 야외수술에 의한 감염, 난자의 이동과 수송에 의한 영향 그리고 주입 미숙 등이 주요 원인인 것으로 생각되며 융해 후 생존효율이 높은 수정란의 준비, 이식 기술의 개선과 자궁상태가 청결한 비경산돈의 이식으로 임신율을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제36권3호
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• pp.173-181
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• 2012

Sphingosine-1-phosphate (S1P) has a many function involved proliferation, differentiation and survival of many cells. In this study, to investigate whether S1P improve the developmental competence of porcine embryos, 50 nM of S1P were supplemented during in vitro maturation (with EGF or without EGF) medium and/or in vitro culture (IVC) medium. Addition of S1P was significantly increased the rate of oocytes reaching metaphase II (MII) compared to the control (83.5 vs. 64.1%) in without EGF medium, but not with EGF medium (89.5 vs. 84.6%). When treated with $1{\mu}M$ of N1N-dimethylsphingosine (DMS), a sphingosine kinase inhibitor which is blocked endogenous generation of S1P, the meiotic progression rates to MII stage (without EGF: 45.2 and with EGF: 66.7%) were significantly decreased and degeneration rates (without EGF: 51.2 and with EGF: 30.1%) were increased in both medium compared to control group during IVM periods. Also, the rates of blastocyst formation was significantly increased in the S1P treated group compared to control group (29.0 vs. 19.2%) of EGF supplemented medium, whereas there were no effect in the EGF free medium (9.0 vs. 10.5%). After 12 h IVM, the phosphorylation of ERK1 and ERK2, which is major signaling pathway of MAP kinase, were increased in the S1P group than that of control or DMS group. When supplemented of S1P during IVC, the rates of blastocyst formation and total cell number (30.2% and 40.6) were significantly increased in S1P-treated group compared with control (20.1% and 32.5), DMS (12.3% and 25.1), and S1P plus DMS group (24.7% and 33.6). The percentage of apoptosis nuclei in the S1P group was significantly decreased than other groups. Also, the rates of blastocyst formation (26.7 vs. 14%) and total cell number (42.8 vs. 32.5) were significantly increased in the S1P group than those of control group when S1P added during the entire IVM and IVC periods. Taken together, our results indicate that S1P supplementation in IVM and/or IVC medium affects beneficial effect of meiotic maturation and subsequent developmental competence of porcine embryos.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권2호
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• pp.131-138
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• 2001

생쥐 초기배의 배반포 발달율이 BSA첨가 배양액에 Barodon-FX(equation omitted) 첨가로 증가되지 않았으나 PVP 첨가 배양액에 0.25% 첨가에서는 부화배반포 발달율이 54.7%로 대조구(32.5%)보다 크게 향상 되었다(P ＜0.05). 1∼2% Barodon 첨가는 배발달을 월등히 저하시켰다. Barodon 첨가에 따른 체세포 증식율은 BOEC와 GC의 경우 0.25∼0.5%에서 대조구보다 각각 24∼40%와 17∼22%더 크게 증가되었다(P＜0.05). 그러나 GC와 CC에서는 1%이상 첨가시 세포증식이 크게 억제되었다(P ＜0.05). Barodon의 효과는 체세포간에 큰 차이가 있었다. 소 초기배에서 상실배이상의 배발달율은 BOEC와 GC 공배양조건에서 Barodon 0.5% 첨가에서 대조구보다 크게 향상되었다(P＜0.05). 그러나 다른 처리 수준에서는 배 발달율이 대조구와 차이가 없었다. 결론적으로 Barodon의 세포증식효과는 세포종류에 따라 차이가 많았으며 0.5% 수준의 첨가는 소 초기배의 배반포발달율을 향상시킬 수 있었다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제30권9호
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• pp.1245-1252
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• 2017

Objective: Phellodendron amurense (P. amurense) and Humulus japonicus (H. japonicus) are closely involved in anti-oxidative response and increasing antioxidant enzymes activities. However, the effects of their extracts on development of preimplantation bovine embryos have not been investigated. Therefore, we investigated the effects of P. amurense and H. japonicus extracts on developmental competence and quality of preimplantation bovine embryos. Methods: After in vitro fertilization, bovine embryos were cultured for 7 days in Charles Rosenkrans amino acid medium supplemented with P. amurense ($0.01{\mu}g/mL$) and H. japonicus ($0.01{\mu}g/mL$). The effect of this supplementation during in vitro culture on development competence and antioxidant was investigated. Results: We observed that the blastocysts rate was significantly increased (p<0.05) in P. amurense ($28.9%{\pm}2.9%$), H. japonicus ($30.9%{\pm}1.5%$), and a mixture of P. amurense and H. japonicus ($34.8%{\pm}2.1%$) treated groups compared with the control group ($25.4%{\pm}1.6%$). We next confirmed that the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) were significantly decreased (p<0.01) in P. amurense and/or H. japonicus extract treated groups when compared with the control group. Our results also showed that expression of cleaved caspase-3 and apoptotic cells of blastocysts were significantly decreased (p<0.05) in bovine blastocysts derived from both P. amurense and H. japonicus extract treated embryos. Conclusion: These results suggest that proper treatment with P. amurense and H. japonicus extracts in the development of preimplantation bovine embryos improves the quality of blastocysts, which may be related to the reduction of ROS level and apoptosis.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.59-67
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• 2000

본 연구는 핵이 제거된 소난자 내에 소의 태아 섬유아세포를 이식한 후 난자의 발달능력을 조사하였다. 소 태아 섬유아세포는 45일된 응성 태아로부터 분리한후 MitoTracker로 염색하고 세포 주기를 동기화시키지 않은 세포를 핵이 제거된 소난자의 위란강 내에 이식하였다. 섬유아세포와 소난자의 복합체는 전기 자극을 주어 융합시키는 방법을 이용하였으며, 융합된 난자는 Calcium ionophore와 6-DMAP를 이용하여 난활성을 유도시킨 다음 CR1aa 에서 배양하였다. 핵치환 된 난자의 핵은 핵질 응축과정, 팽대과정, 전핵 형성과정이 일어났으며, 이러한 과정에서 재구성된 난자는 분열 과정을 거쳐 18∼26시간 사이에는 2-세포기로 발달하였다. 섬유아세포의 미토콘드리아는 핵치환시 난자 내로 이전되었는데 이것들은 난자 내에서 빠르게 사라지는 것으로 관찰되었으며, 핵융합 후 8시간째에는 섬유아세포의 미토콘드리아가 전혀 관찰되지 않았다. 2-세포기로 분열된 난자의 21% 가 이식 가능한 단계인 배반포 단계까지 발달하였다. 이러한 결과는 소의 태아 섬유아세포가 탈핵된 소난자 내에서 성공적으로 재분화과정을 거치며, 이렇게 재조합 된 수정란은 배반포 단계까지 발달이 가능하다는 것을 보여주고 있다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제28권1호
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• pp.33-40
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• 2001

Objective: This study was to establish the human embryonic stem (ES) cells derived from frozen-thawed blastocyst stage embryo that were destined to be discarded after five years in routine human IVF-ET program. Methods: Frozen-thawed and survived human blastocysts were treated by immunosurgery, and recovered ICM cells were cultured onto STO feeder cell layer and ICM colony was subcultured by mechanical dissociation into clumps. To identify ES cell, alkaline phosphatase staining and expression of Oct4 in replated ICM colonies were examined. Also, to examine the possibility of ES cell differentiation, retinoic acid (RA), basic fibroblast growth factor (b-FGF), nerve growth factor (NGF) were added in culture medium. In addition, to classify the specific cell type, differentiated cells were stained by indirect immunocytochemistry. Results: One ICM colony recovered from frozen-thawed six blastocysts was subcultured, continuously replated during 40 passage culture duration without differentiation. Subcultured colonies were strong positively stained by alkaline phophatase. When the expression of Oct4 in cultured ES colony was examined, Oct4b type is more clearly indicated than Oct4a one although there was not detected in embryoid body or differentiated cells. In differentiated cardiomyocytes from ES colony, cells were beaten regularly (60 times/min). In differentiated neural cells from ES colony, neurofilament (NF) 200 kDa protein, microtubule associated protein (MAP) 2 and ${\beta}$-tubulin of specific marker in neurons, glial fibrillary acidic protein (GFAP) of specific marker in astrocytes and galactocelebrocide (GalC) of specific marker in oligodendrocytes were confirmed by indirect immunocytochemistry. Also, muscle cells were detected by indirect immunocytochemistry. In addition, ES colonies can be successfully cryopreserved. Conclusion: This study suggested that establishment of human ES cells can be successfully derived from frozen-thawed blastocysts that were destined to be discarded, and obtained specific cell types (cardiomyocytes, neurons and muscle cells) through the in vitro differentiation procedures of ES cells.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제5권1호
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• pp.17-21
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• 2001

생쥐 초기배아의 체외배양 시 부화에 관련된 단백질 분해효소의 발현 시기와 존재부위를 알아보고 trypsin억제제 benzamidine을 배양액에 첨가하여 부화효소의 역할을 살펴보았다. 부화 효소로 제안되고 있는 trypsin 유사효소의 발현부위를 확인하기 위해 rhodamine이 부착되어 있는 Trypsin subsfrate probe를 이용하여 형광염색하였다. 생쥐 배아의 발생과정에서 trypsin 유사효소의 발현은 후기 상실 배아에서부터 관찰되었으며, 포배기 배아에서는 영양배엽 표면에서 전체적으로 관찰되었다. 특히, 부화가 진행되고 있는 배아의 부화 개시 부위 (blebbing)에서 그 염색 정도가 상대적으로 강함을 확인할 수 있었다. 생쥐 4-세포기 배아의 체외배양 시 배양액에 trypsin 억제제인 benzamidine을 ImM 농도로 첨가하였을 때 포배기로의 발생률은 영향을 받지 않았지만, 부화율은 15.8%로 대조군의 83.0%에 비해 유의하게 (p<0.02) 낮게 나타났다. 배아의 발생단계에 따라 5mM의 benzamidine을 12시간 동안 처리한 경우 부화율이 8.7%로 대조군의 83.0%에 비해 유의하게(p<0.01)낮았다. 결론적으로, trypsin 유사효소는 초기 포배기에서부터 발현되기 시작하며 특히, 후기 포배기에서 그 효소의 작용이 부화 과정에 커다란 영향을 미치는 것이 확인되었다. 또한 배양중 부화 과정에서는 배아 자체에서 분비되는 trypsin 유사효소의 역할만으로도 부화할 수는 있지만 생체 내에서는 배아와 자궁내막 상피와의 상승적 상호 작용에 의해 부화과정이 더 활발히 진행되는 것으로 생각된다.

• 한국자원식물학회지
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• 제31권5호
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• pp.515-521
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• 2018

본 시험은 최근 소비트렌드의 변화에 따라 소비자들이 쉽고 편하게 먹을 수 있는 씨 없는 감 개발의 선결조건인 배수체(12x) 교배 모본을 선발하기 위해 수행되었다. 염색체가 배가된 배수체 개체를 얻기 위해 교배 종자의 배배양을 통해 얻은 유묘의 생장점에 콜히친을 처리하였다. 콜히친을 0.03, 0.05%, 0.1% 등 3수준으로 처리한 결과, 0.05%에서 염색체가 배가된 개체의 발생률이 가장 높았다. 콜히친 처리 후 우리는 신초와 뿌리의 발생을 유도하기 위한 배지 조건을 구명하는 시험을 수행하였다. 신초는 $10{\mu}M$, 30 zeatin이 각각 첨가된 1/2MS배지에서 생장이 잘 되었으며, 뿌리는 10 mM NAA+5% DMSO에 5초 동안 침지 후 1/2MS배지에 배양하였을 때 생장이 잘 되었다. 또한 콜히친 처리에 의해 염색체가 배가된 개체(12x)의 기공 특성을 조사한 결과 염색체가 배가된 개체(12x)는 염색체 배가가 되지 않은 개체(6x)와 교배친(6x) 보다 잎의 공변세포 밀도는 더 적고, 크기는 더 큰 경향이었다.

• 농업과학연구
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• 제26권2호
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• pp.19-24
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• 1999

본 실험은 배지 및 호르몬이 돼지 난포란의 체외성숙 및 체외발생능에 미치는 영향을 구명하기 위하여 실시하였다. 기본 배지는 TCM-199, Waymouth MB751/1 및 BMOC-II를 사용하였으며, 각각의 배지에 첨가된 호르몬은 hCG와 FSH를 사용하였다. 실험에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. TCM-199을 기본배양액으로 하여 돼지난포란을 체외배양하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG 단독첨가의 경우가 78.05%, FSH 단독첨가에서 72.50%, hCG와 FSH의 병용첨가의 경우가 67.50%로서 호르몬을 첨가하지 않은 처리구의 54.29%에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높은 성적을 나타냈으며, 수정후 같은 배지조건하에서 난할률은 호르몬 첨가의 경우(hCG 46.88%, FSH 31.04%, hCG+FSH 37.04%)가 무첨가구(89.47%)에 비하여 유의적(P<0.05)으로 낮았다. 2. Waymouth MB751/1을 배양액으로 하여 체외배양하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG가 71.43%, hCG+FSH 병용첨가의 경우가 80.00%로서 호르몬을 첨가하지 않은 처리구의 25.64%에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높은 성적을 나타냈다. 그러나, 난할률은 호르몬 첨가의 경우(hCG 46.67%, FSH 36.00%, hCG+FSH 35.71%)가 무첨가구(60.00%)에 비하여 낮은 성적을 나타냈다. 3. BMOC-II를 기본배양액으로 하여 체외배양 하였을 때, 체외성숙률은 배양액내에 hCG 단독첨가 66.7%, FSH 단독첨가 91.89%, hCG+FSH 병용첨가 81.82% 및 무첨가구 66.67%로 각각 나타나서 FSH 단독첨가의 경우가 가장 높은 성적을 나타냈다. 또한, 난할률은 hCG 단독첨가 79.17%, FSH 단독첨가 50.00%, hCG_FSH 병용첨가 66.67% 및 무첨가 81.82%로 각각 나타났다.