• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제16권1호
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• pp.23-28
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• 2003

The present study was undertaken to investigate the effects of PVP concentration and exposure temperature to vitrification solution on the post-thaw survival, in vitro maturation and development of immature bovine oocytes (germinal vesicle stage). The vitrification solution (VS) consisted of 40% ethylene glycol (EG)+0.5 M sucrose (S)+10% FBS. PVP was added to VS: 0%, 5% or 10%. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were diluted in VS as one step, after 2 min the COCs were loaded in straw and vitrified by direct immersion into liquid nitrogen. For thawing, the straws were plunged into $30^{\circ}C$ water bath for 10s. After thawing, the oocytes were diluted in 0.5 M (in DPBS with 10% FBS) sucrose solution for 5 min. The survival rate (FDA-test and trypan blue) of immature bovine oocytes was measured. The survival rate was higher in 5% PVP (91.5%) than in 0% (64.2%) or in 10% PVP (79.7%). The proportion of metaphase II formation was 69.35% in control (no vitrified COCs), 9.3% in 40% EG+0.5 M S+0% PVP and 21.05% in 40% EG+0.5 M S+5% PVP (p<0.05). The effect of room temperature ($25^{\circ}C$ for 10 min) and cold temperature ($4^{\circ}C$ for 10 min) on COCs were determined in this study. After IVF, the cleavage and blastocysts rate of oocytes exposed to room temperature and cold temperature in VS+5% PVP was significantly different (2 cell: 63.20% vs 37.97%, blastocysts: 18.40% vs 2.53%). The cleavage rates of frozen-thawed oocytes were 20.53% with PVP and 22.13% without PVP (p>0.05). Two out of 151 oocytes (1.32%) developed to blastocyst stage after frozen-thawed with 5% PVP (p>0.05). Development of oocytes after frozen-thawing to the 2 cell were not significantly affected with or without PVP following IVF. However, the vitrification of immature bovine oocytes with PVP maintained the ability to develop to the blastocyst stage after IVM-IVF and IVC, while no blastocysts were obtained from oocytes vitrified without PVP. These results suggested that PVP has a protective role for vitrification of immature bovine oocytes as far as survival is concerned, however, the protection was not sufficient enough to support blastocyst formation.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권3호
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• pp.215-221
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• 2002

본 연구는 일정량의 항산화제(NAC, ebselen 및 GSH)와 성장인자(EGF, PDGF)의 혼합첨가가 돼지 체외수정란의 체외배양에 미치는 영향을 검토하였다. 1. NCSU 23 배양액에 NAC 1nm과 NAC에 EGF 100ng/$m\ell$비 및 PDGF 5ng/$m\ell$를 각각 혼합 첨가하여 체외배양을 실시한 결과, 상실배기 이상 발육된 체외발육율은 각각 28.1%, 32.3% 및 35.3%로서 NAC와 PDGF 혼합처리구가 대조 구보다 다소 높은 체외발육율을 나타냈으나 통계적 유의성은 없었다(P>0.05). 2. NCSU 23 배양액에 ebselen 10$\mu\textrm{m}$과 ebselen에 EGF 100ng/$m\ell$ 및 PDGF 5ng/$m\ell$를 각각 혼합첨가하여 체외발육율을 조사한 결과, 상실 배기 이상 발육된 수정란의 체외발육율은 각각 17.8%, 36.9% 및 40.3%로 ebselen과 성장인자의 혼합처리구가 대조구보다 통계적 유의하게 높은 체외발육율을 나타냈다(P<0.05). 3. NCSU 23 배양액에 GSH 100$\mu\textrm{m}$과 GSH에 EGF 100ng/$m\ell$ 및 PDGF 5ng/$m\ell$를 각각 혼합 첨가배양하여 상실배기 이상 발육된 수정란의 체외발육율은 각각 24.4%, 30.5% 및 27.7%로 GSH과 EGF 혼합처리구가 여타구보다 다소 높은 체외발육율을 나타냈지만 통계적 유의성은 없었다(P>0.05). 4. 모든 처리구에서 배반포기 수정란의 세포수는 커다란 차이가 인정되지 않았으나(P>0.05), 체외배양액에 ebselen과 성장인자를 혼합첨가하여 체외배양한 처리구에서는 대조구에 비해 통계적으로 유의하게 높은 세포수를 나타냈다.(P<0.05).

• 한국가축번식학회지
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• 제25권1호
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• pp.19-28
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• 2001

소 미성숙 난자 (GV stage)의 동결에 중요한 영향을 미치는 평형시간과 동결속도가 융해후 생존율 및 배발달율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 미성숙 난자의 동결 융해후 체외성숙, 체외수정 및 배반포 발달 능력을 알아보았다. 본 실험에 사용한 동결액의 조성은 침투성 보호제(Ethylene glycol, EG)와 비 침투성 보호제(Ficoll ; F, polyvinylpyrrolidone; PVP, Sucrose; S, Trehalose ; T)를 혼합하여 네가지 조성의 동결액을 준비하였다. 즉EFT: 10% EG + 5% F + 0.05M T, EFS: 10% EG + 5% F + 0.05M S, EPT: 10% EG + 5% P + 0.05M T, EPS: 10% EG + 5% P + 0.05M S이다. 네가지 동격액 (EFT, EFS, EPT, EPS)을 이용하여 미성숙 소 난자 (GV stage)의 최적 평형 시간을 알아보기 위하여 각각 10, 15, 20분의 평형후 동결 응해하였다(실험 1). EPT액에서 15분의 평형시간이 가장 좋은 생존율을 나타내었다(83.05%). 동결 속도가 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각 17$^{\circ}C$, $0^{\circ}C$ 및 -6$^{\circ}C$로 동결 속도를 달리 설정하여 동결 융해를 실시하였다(실험 2). 융해후 생존율은 대부분 $0^{\circ}C$로 시작하는 동결속도에서 가장 좋은 성적을 나타내었다. 즉 EFT, EPT, EPS에서 각각 78.1, 73.7, 74.7%의 생존율을 나타내었다. 동결융해 하지 않은 신선란과 동결 응해한 미성숙 난자의 핵 성숙율은 각각 87.2%와 62.3%가 metaphase II로 발달하였다. 동결 응해 미성숙 난자의 IVM, IVF후 난분할율은 EFT, EFS, EPT 그리고 EPS에서 각각 32.57, 23.21, 38.39 그리고 21.33%로 EPT에서 가장 높았으나 유의차는 없었다. 배반포 발달율도 각각 2.86, 3.57, 4.46 그리고 0.47%로서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 동결융해 미성숙 난자의 IVM, IVF후 TCM199와 CR-1aa배양액을 이용하여 소 난관상피세포(BOEC)와 공배양 한 결과 배양액의 종류에 따라 난분할율과 배반포 발달율에서는 차이를 보이지 않았다. 또한 미성숙 소 난자의 동결 융해후 얻은 배반포 수정란을 자연발정 Holstein 수란우에 7일째 비외과적으로 이식하였다. 6두에 9개의 수정란을 이식하여 2두가 임신이 확인되었으나 1두는 45일경 유산되었고, 나머지 1두는 장기재태로 분만을 유도하였으나 사산되었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권2호
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• pp.99-105
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• 2006

The growing oocytes become progressively capable of resuming meiosis, and full meiotic competence appear when they are about 80% of the size of fully grown oocytes. As hormonal influences vary at different stages of reproductive cycle, the size of oocytes may vary according to the reproductive stages. The present study was designed to compare the diameter between the ovulated and freshly collected immature canine oocytes. The ovulated oocytes were collected 72 hr after ovulation by oviductal tube flushing by laparotomy under general anesthesia. Immature oocytes were collected by ovarian slicing method. Diameter of all oocytes was measured directly using epiflurescence microscope with a calibrated micro-eyepiece micrometer at ${\times}200$ magnification. The thickness of zona pellucida and diameter of cytoplasm were measured separately and recorded. A total of 2209 zona intact oocytes were collected, among them 628 from anestrus, 675 from follicular, 838 from luteal and 68 by fallopian tubes flushing methods. The average number of oocytes was 104.7, 168.8, 119.7 and 11.3 for anestrus, follicular, luteal and fallopian tubes flushing methods, respectively. The average diameters of the ooplasm and oocyte were significantly varied in different reproductive stages as well as with ovulated oocytes (P<0.05). The average diameter of ooplasm and oocyte was 115.6 and 127.7, 143.0 and 162.0, 134.6 and 150.6, 159.6 and 185.6 for anestrus, follicular, luteal and ovulated oocytes, respectively. Highest number of oocytes with larger diameter could be collected from the follicular and luteal stages. In conclusion, the follicular and luteal ovaries are the best sources of oocytes for canine IVM.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.97-108
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• 2000

본 실험을 통하여 얻어진 결과를 요약하여 보면, 1. 소난포(＜2 mm), 중난포 (2~6 mm) 및 대난포 (＞6 mm)에서 각각 184개, 157개 및 101개의 난포란을 회수하여 442개의 난포란을 채취하였으며, 난포의 크기별로 볼 때 Grade I인 난포란의 회수는 소난포에서 64개 (34.8%), 중난포에서 31개 (19.7%) 및 대난포에서 5개 (5.0%)를 회수하였으며, 등급별 총 회수율은 Grade I, II 및 III 에서 각각 100개, 170개 및 172개를 회수하였다. Grade I, II, 및 III의 난소당 채란된 수는 각각 2.4개 및 4.2개로 평균 난소당 10.7개의 난포란을 회수하였다. Grade I, II, 및 III 의 미성숙 난포란, 각각 200개, 196개 및 203개를 체외성숙 배양액에서 22~24 시간동안 배양한 결과, 188개(94.0%), 155개 (79.1%) 및 147개 (72.4%)의 난포란이 성숙되었으며, 수정율은 각각 88.3%, 76.6% 및 72.5% 였다. Grade I의 난포란의 성숙율 및 수정율이 Grade II와 III에 비하여 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났다. TCM-199 배양액, 난관 상피세포가 첨가된 배양액 또는 난관 상피세포의 단순배양액 (CM) 에서 상실배의 발달율은 각각 24.1%, 31.2% 및 21.9%로서 CM 배양액보다 난관 상피세포에서 유의적 (P＜0.05)으로 높은 발달율을 얻었으며, 배반포 수정란의 경우, 발달율이 각각 12.4%, 24.7% 및 18.2%로서 TCM-199 배양액보다 난관 상피세포를 첨가한 배양액에서 배양한 것이 유의적 (P＜0.05)으로 높은 발달율을 보였다. 2. 동결보호제에 대한 평형시간이 l분, 2분 및 3분일 때, 체외수정란의 생존율은 각각 82.9%, 73.3% 및 32.1%로서, 평형시간이 1분과 2분일 때의 생존율이 3분 동안 평형한 수정란보다 생존율이 유의적 (P＜0.05)으로 높았으며, 3분 동안 평형시에는 수정란의 생존율에는 치명적이었다. 배반포 수정란을 동결보존한 후의 생존율은 72.7%였으며, 상실배는 33.3% 가 생존하여 상실배보다는 배반포 수정란의 생존율이 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났다. 3. 배반포 수정란을 105두의 수란우에 이식한 결과, 임신우 49두(46.7%)가 임신되었으며, 그 중에서 12.2% (6/49) 의 유산율과 6.1%(3/49)의 사산율을 보였고, 최종 40두(81. 7%)가 분만하였다. 이러한 결과로 보아 난포란의 체외배양 시 이식가능한 체외수정란의 생산율은 25%로서, 이는 난소 한개당 2.7개의 체외수정란 생산을 나타낸다. 생산된 수정란을 수란우에 이식한 결과 46.7% 의 임신율을 보여 향후 안정적인 쌍자 분만을 위해서 한우 수정란을 젖소의 대리모를 이용하는 방안에 대해 더욱 연구해 보아야 할 것으로 사료된다.