• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제19권5호
• /
• pp.495-501
• /
• 2009

A new spore display method is presented that enables recombinant proteins to be displayed on the surface of Bacillus spores via fusion with InhA, an exosporium component of Bacillus thuringiensis. The green fluorescent protein and $\beta$-galactosidase as model proteins were fused to the C-terminal region of InhA, respectively. The surface expression of the proteins on the spores was confirmed by flow cytometry, confocal laser scanning microscopy, measurement of the enzyme activity, and an immunogold electron microscopy analysis. InhA-mediated anchoring of foreign proteins in the exosporium of Bacillus spores can provide a new method of microbial display, thereby broadening the potential for novel applications of microbial display.

• Parasites, Hosts and Diseases
• /
• 제39권2호
• /
• pp.119-132
• /
• 2001

An immunoelectron microscopy employing immunogold labeling method was performed to detect tissue origin of Dl fraction (DIA) among 5 antigenic protein fractions partially purified by DEAE- anion exchange chromatography from water- soluble crude antigen (PIWA) of adult Paragonimus iloktsuenensis. Immune reactions of adult worm tissues with rabbit serum immunoglobulin immunized with crude antigen (PI-Ig) and D1 antigen (D1-Ig), as well as rat serum immunoglobulin infected with P. iloktsuenensis were observed. DlA showed strong antigenicity in the intestinal epithelium of the worms during the early infection period of 2-4 weeks after infection. The vitellaria also showed stronger antigenicity than the other tissue sites in immune reaction of tissues against all immunoglobulins from 4 to 33 weeks after vitelline development. Therefore, it is suggested that DlA was mainly originated from the intestinal epithelial tissues before the development of vitelline gland of the parasites. Immune-reactivity of two immunoglobulins (PI-Ig, Dl-Ig) was significantly different in intestinal epithelial cytoplasmic protrusions (CP) and intestinal epithelial secretory granules (SG). In the experimental group with Dl-Ig, gold particles were labeled significantly in CP than in SG when compared to the PI-Ig group. Thus, the major antigenic materials in Dl antigen having a strong antigenicity in the early infection period was considered to be originated from the intestinal epithelial tissue .

• Applied Microscopy
• /
• 제24권2호
• /
• pp.78-92
• /
• 1994

Lysozyme has been reported to be present in the secretory granules of the Paneth cell, and lysozyme immunoreactivity has been detected by immunogold method in Paneth cells of the intestine of human, mouse and rat. The present study was aimed at clarifying the intracellular distribution and changes of the lysozyme immunoreactivity in rabbit Paneth cell after common bile duct ligation of rabbit, using the electron microscope immunogold technique. Healthy adult rabbits weighing about 2kg body weight were divided into normal and bile duct ligated groups. Common bile duct ligation was performed aseptically under ether anesthesia. Experimental animals were sacrificed on the 1st, the 3rd, the 5th, the 7th and the 14th day after the operation. Mucosal specimens from the intestinal gland of ileum were fixed in 2.5% glutaraldehyde-1.5% paraformaldehyde, followed by 1% osmium tetroxide, embedded in araldite mixture, cut with LKB-V ultratome. Ultrathin sections were placed on parlodion coated nickel grids (200mesh). The section-bearing grids were floated upside down on the added substance in a moist chamber at room temperature except for the primary antibody step, which was at $4^{\circ}C$. Sections were etched with a saturated solution of sodium m-periodate for 60min. After etching, sections were pretreated with 0.02M tris buffered saline (TBS), pH 8.4, with 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma) for 60min, then treated polyclonal rabbit anti-human lysozyme (Dakipatts) diluted 1 : 50 in TBS with 0.1% BSA for 20hr. Subsequently, grids were incubated 60min in biotinylated goat anti rabbit IgG (Amersham) diluted 1 : 100 in TBS with 0.1% BSA. After this, sections were incubated 60min on streptavidin gold G10 (Amersham) diluted 1 : 50 in TBS with 0.1% BSA. After each step, the grids were briefly rinsed with TBS with 0.1% BSA. After the strepavidin gold step, the sections were jet washed with distilled water. Counterstain of the sections performed by uranyl acetate and lead citrate, and observed with JEM 100 CX II electron microscope. Observed results were as follow; 1. Secretory granules of mouse Paneth cells have a lysozyme immunoreactivity and also eosinophil leucocyte of rabbit applied for the positive-control stain, are well labeld with gold particles. 2. Normal rabbit Paneth cells have a lysozyme immunoreactivity restricted on the secretory granules. 3. Amount lysosomes containing myelin figures in the Paneth cells were significantly increased from 5th day after the common bile duct ligation. 4. Immunoreactivity of Paneth cell secretory granules were more activated on the 3rd day after the common bile duct ligation as compared with those of the normal animal. But the lysozyme immunoreactivity were decreased from the 5th day after the common bile duct ligation. 5. Considering the above finding, lysozyme contained Paneth cell are affected following of common bile duct ligation, whereas lysosomes containing myelin-figure do not exhibit any immunoreactive relationship with those of secretory granules.

• Parasites, Hosts and Diseases
• /
• 제42권4호
• /
• pp.185-193
• /
• 2004

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite, which invades a wide range of hosts including humans. The exact mechanisms involved in its invasion are not fully understood. This study focused on the roles of $Ca^{2+}$ in host cell invasion and in T. gondii replication. We examined the invasion and replication of T. gondii pretreated with several calcium modulators, the conoid extrusion of tachyzoites. Calmodulin localization in T. gondii were observed using the immunogold method, and $Ca^{2+}$ levels in tachyzoites by confocal microscopy. In light microscopic observation, tachyzoites co-treated with A23187 and EGTA showed that host cell invasion and intracellular replication were decreased. The invasion of tachyzoites was slightly inhibited by the $Ca^{2+}$ channel blockers, bepridil and verapamil, and by the calmodulin antagonist, calmidazolium. We observed that calcium saline containing A23187 induced the extrusion of tachyzoite conoid. By immunoelectron microscopy, gold particles bound to anti-calmodulin or anti-actin mAb, were found to be localized on the anterior portion of tachyzoites. Remarkably reduced intracellular $Ca^{2+}$ was observed in tachyzoites treated with BAPTA/AM by confocal microscopy. These results suggest that host cell invasion and the intracellular replication of T. gondii tachyzoites are inhibited by the calcium ionophore, A23187, and by the extracellular calcium chelator, EGTA.

• 대한의생명과학회지
• /
• 제2권1호
• /
• pp.1-12
• /
• 1996

Spirometra erinacei의 유충인 sparganum(metacercoid)에 감염되었을 때 호산성백혈구의 증가와 IgE 항체역가가 증가된다는 보고가 있다. 이 기생충에 감염되었을 때 IgG 항체와 IgE 항체를 유도하는 충체의 항원성분의 소재를 면역세포조직화학적 방법으로 충체의 성체와 유충에서 비교하였고, 또한 충체의 추출물을 SDS-PSGE와 EITB를 이용하여 IgG와 IgE 항체 유도 항원성분의 면역적 특성도 추구하였다. IgG와 IgE 항체 유도성분은 성체와 유충의 근층에서 공통적으로 분포되어 있었고, IgG 항원성분은 근층 뿐만 아니라 외피층과 유조직층에서도 반응이 나타났으며, 성체의 수태편절에서는 자궁 내에 있는 충난의 표면에서도 반응이 나타났다. 충체의 외피층에서 항원성분을 면역황금 표지법으로 관찰한 결과, 충체의 외피층(tegument)에서 IgG 항원성분의 분포밀도가 IgE 항원성분의 밀도보다 컸다. 충체의 추출물 중 IgG, IgE 유도 항원성 단백질의 면역학적 특성을 비교하였다. 성체의 추출물의 43개 분회 중 21개 분획이 IgG 항원성분으로서 반응하였고, IgE 항원성분으로는 21개 분획에서 반응하였다. 이들 중 11개 분획 (410, 304, 268, 174, 162, 116, 92, 86, 72, 60, and 59 kDa)에서 IgG와 IgE가 교차반응하였으며, 유충의 추출물의 36개 분획 중 IgG 항원성분으로 22개의 분획에서 반응이 나타났고, IgE 항원성분으로는 13개의 분획에서 반응하였으며, 이들 중 5개 분획(204, 116, 92, 79, and 59 kDa)에서 IgG와 IgE가 서로 교차반응하였다.

• Applied Microscopy
• /
• 제40권4호
• /
• pp.261-266
• /
• 2010

미토콘드리아에서 생성하는 ATP는 미토콘드리아의 속막에 존재하는 전자전달계 효소(electron transferase)에 의해 생성되며, 이러한 전자전달계 효소는 복합체 I, II, III, IV, V로 구성되어 있다고 알려져 있다. ATP는 ATPase에 의해 생성되며, ATPase는 $F_0$와 $F_1$ 소복합체로 구성되어 있다. 미토콘드리아의 외막에는 Porin 또는 VDAC(voltage-dependent anion-selective channel)이라고 알려져 있는 미세한 구멍 형태의 단백질이 존재하며, 세포질에 존재하는 succinate, malate, ATP와 같은 음전하용질 또는 전자를 선택적으로 통과시키는 역할을 수행하는 것으로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 소의 심근 미토콘드리아에 존재하고 있는 porin과 ATPase의 기능과 분포의 관계를 알아보기 위하여, porin과 ATPase Ⅴ-${\beta}$ 항체를 면역반응법을 이용한 광학현미경과 이중면역반응법을 이용한 형광현미경으로 확인하고, 심근 미토콘드리아의 두 단백질 분포를 면역황금표지법을 이용한 전자현미경으로 관찰하였다. 미토콘드리아에서 porin 항체에 대한 미토콘드리아 조직항원의 발색은 조직내에서 전반적으로 관찰할 수 있었으며, ATPase 항체에 대한 조직항원의 발색은 세로면에서 관찰되었다. 이중면역응법에서 porin 항체와 ATPase는 각각 다른 조직에서 발색이 관찰되거나, 같은 조직 내에서 관찰되었다. 면역황금표지법에서 porin 항체는 미토콘드리아의 바깥막에서 황금입자가 표지된 것을 확인할 수 있었으며, ATPase는 미토콘드리아의 속막에서 황금입자가 표지된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 ATPase 항체가 황금입자로 표지되지 않은 미토콘드리아도 확인되었다. 이러한 결과로 porin 항체와 ATPase 항체는 미토콘드리아의 바깥막과 속막에 각각 분포양상을 확인하였다. porin 항체의 발색으로 인한 조직 내의 미토콘드리아가 존재하고 있음을 확인할 수 있었으며, ATPase 항체의 발색으로 인한 ATP를 생성하는 미토콘드리아를 확인할 수 있었다. 하지만 porin 항체의 반응으로 확인된 미토콘드리아가 반드시 ATP를 생성하는 것은 아니라는 것을 추측할 수 있었다.

• KSBB Journal
• /
• 제21권5호
• /
• pp.325-330
• /
• 2006

Bio-MEMS를 기반으로 microfilter와 백금 전극이 내재되어 있는 microbiochip을 제작하였다. 우리는 이 chip으로 microbead에 indirect ELISA 방법으로 항원-항체를 반응시키고 전기 신호 검출 방법을 이용하여 반응 여부를 판단하였다. 이 때 신호 증폭을 위해 silver enhancer를 사용하였다. Chip 상에서 항원-항체 반응 조건을 최적화하기 위해 pH, temperature, flow time, flow rate, silver enhancer time을 결정하였다. 이렇게 최적화된 조건을 바탕으로 짧은 시간 안에 소량의 시료로 immunoassay를 성공적으로 수행할 수 있었다. 전기 신호 검출 방식을 사용함으로써 biosensor 장비의 소형화와 다중 시료 측정과 자동화를 biosensor에서 적용할 수 있는 가능성을 제시하였다.

• Applied Microscopy
• /
• 제32권2호
• /
• pp.91-105
• /
• 2002

포유동물의 콩팥에서 오줌 농축기전에 중요한 요소(urea)의 이동에 관여하는 요소운반체 (urea transporter, UT)에는 요세관에서 발현되는 요소운반체인 UT-A와 적혈구에서 발현되는 요소운반체인 UT-B가 있다. 최근 UT-A에는 UT-A1, UT-A2, UT-A3, UT-A4, UT-A5 등 5종류가 있음이 밝혀졌다. 이 연구에서는 콩팥내 요세관 세포에서 UT-A1, UT-A2 및 UT-A4를 표지하는 것으로 알려진 UT-A (L403)의 분포를 밝히고자 하였다. Sprague-Dawley계 흰쥐($200{\sim}250g$)의 콩팥을 대상으로 정상군, 탈수군(식수를 3일간 공급하지 않은 군) 및 수분과잉공급군(3%의 sucrose를 섞은 식수를 3일간 자유롭게 먹였다)의 3군으로 나누었다. 콩팥은 복대동맥을 통하여 2% paraformaldehyde-lysine-periodate (PLP) 또는 8% paraformaldehyde용액으로 10분간 관류 고정하였다. 콩팥조직절편은 UT-A에 대한 토끼 다클론항체를 이용하여 포매전면역염색법을 이용한 과산화효소법과 면역도금법을 시행한 후 광학 및 전자현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 흰쥐 콩팥에서 UT-A1은 속수질집합관의 세포질에 산재하여 분포하고 있었으며, UT-A2는 짧은-헨레고리의 내림가는부분 말단 1/2 부분의 상피세포(I형 세포)와 속수질 초기부분에 있는 긴-헨레고리의 내림가는부분 상피세포(II형 세포)의 세포막에 분포하고 있었다. 속수질집합관내 UT-A1은 탈수군에서는 감소하였으며, 수분과잉공급군에서는 증가하였다. 짧은-헨레고리의 내림가는부분에 있는 UT-A2는 탈수군과 수분과잉공급군 모두에서 증가하되 수분과잉공급군에서 더 증가하였다. 긴-헨레고리의 내림가는부분 중 속수질 초기부분에서 발현되는 UT-A2의 면역반응성은 탈수군에서 현저히 증가하였으나, 수분과잉공급군에서는 정상군에서처럼 약하게 발현되었다. 이상의 연구 결과로 보아 흰쥐 콩팥에서 UT-A1은 속수질집합관의 세포질에 UT-A2는 짧은-헨레고리와 긴-헨레고리의 내림가는부분 상피세포의 세포막에 분포하고 있으며 서로 다른 기전에 의하여 조절되고 있는 것으로 생각된다.

• Applied Microscopy
• /
• 제31권1호
• /
• pp.71-83
• /
• 2001

Laminin은 세포외기질의 주요 구성 당단백질로 알려져 있고 특히 기저막에 다량 분포되어 있어 제 4형 아교질, heparan sulfate proteoglycan 및 entactin과 결속되어 있다. Laminin은 세포외기질에 함유되어 조직의 발생, 분화 및 성숙 등에 직접 및 간접적으로 관련되어 있으며, 특히 세포의 분열, 이동에 관여하고 조직내 기저막의 물질 투과성에 영향을 미쳐 상피의 분화 및 재형성과 관계있음이 많은 학자들에 의하여 보고되어 있다. 최근에는 laminin이 포유동물에서 태자기와 신생아기에서 폐의 발생과 분화에 주요한 역할을 함도 일부 보고되어 있다. 이에 저자는 폐의 발생과정에서 조직 혹은 세포내에서 laminin의 발현과 분포 변화를 면역조직화 학염색법과 면역도금법을 이용해서 추적하고자 하였다. 실험동물로는 발생 제 14일, 제 16일, 제 18일 및 제 20 일의 태자와 생후 1일, 3일 5일 및 7일의 신생 흰쥐를 사용하였으며, 각 실험동물의 폐조직을 절취하고 면역조직화학염색과 면역도금법으로 laminin의 면역활성의 변동을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 발생 제 14일, 제 16일, 제 18일 및 제 20일의 흰쥐 태자와 출생 제 1일의 신생 흰쥐 폐조직에서는 혈관, 기관지 및 폐포의 기저막과 폐포막에서 강한 laminin 면역활성이 지속되었고, 폐포가 형성된 출생 제3일 이후의 흰쥐 폐의 폐포막에서는 laminin 면역활성이 현저히 감소되었다. 2. 흰쥐 태자의 폐조직에서 laminin 면역금과립이 관찰되는 세포는 간엽세포, 혈관내피세포 및 섬유모세포였으나, 신생 흰쥐의 폐에서는 섬유모세포, 제 1형 및 제 2형 폐포세포에서 laminin 면역금과립이 관찰되었으며 금과립이 가장 많이 관찰되는 조직 부위는 공기혈관장벽을 이루는 기저 막이었다. 이상과 같은 실험결과는 태생기에서는 laminin이 주로 폐의 세포외기질에 분포되나 출생 후에는 주로 기저막에 분포되므로 패의 기능이 성숙됨에 따라 laminin의 분포상태에 변동이 일어나고, laminin을 생성하는 세포도 출생 전에는 간엽세포, 혈관내피세포 및 섬유모세포이나 출생 후에는 폐의 실질세포인 제 1형 폐포세포와 제 2형 폐포세포로 합성기능이 이전되는 것으로 생각되었다.