• Neonatal Medicine
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• 제16권2호
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• pp.221-233
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• 2009

목 적 : 신장에서 분비되어 적혈구를 생산하는 빈혈제로 알려진 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO)은 단순히 피를 만드는 조혈기능 뿐 아니라 최근 신경계 보호 및 신경강화 효과가 있다고 발표되고 있지만 주산기 가사로 인한 저산소성 허혈성 뇌병증의 치료제로서 그 기전이 명확하게 밝혀지지 않았다. 저자들은 유전자 재조합 인 에리스로포이에틴(recombinant Human EPO, rHuEPO)을 이용하여 주산기 저산소성 허혈성 뇌병증의 치료제로서 N-methyl-D-aspartate (NMDA) 수용체와 관련된 흥분성 독성작용을 통한 조절 등 그 기전을 알아보고자 하였다. 방 법 : 재태기간 19일된 태아 백서의 대뇌피질 세포를 배양하여 정상산소군은 5% $CO_2$ 배양기(95% air, 5% $CO_2$)에 두었고, 저산소군과 농도별 뇌손상 전 rHuEPO 투여군(1, 10, 100 IU/mL)은 1% $O_2$ 배양기(94% $N_2$, 5% $CO_2$)에서 6시간 동안 뇌세포손상을 유도하였다. 세포성장과 생존력을 평가하기 위해 MTT 실험을 시행하였다. 동물 모델에서는 생후 7일된 신생백서의 좌측 총 경동맥을 결찰한 후 6개 군; 정상산소군, sham-operated군, 저산소-허헐성군, 저산소-허헐성+vehicle군, 저산소-허헐성 손상 전 rHuEPO 투여군, 저산소-허헐성 손상 후 rHuEPO 투여군으로 나누었고, 저산소-허헐성 손상은 특별히 제작한 통속에서 2시간 동안 8% $O_2$ (8% $O_2$, 92% $N_2$)에 노출시켰다. rHuEPO은 뇌손상 전후 30분에 체중 kg당 1000 IU를 투여하였고, 저산소-허헐성 손상 후 7일째 조직을 실험하였다. 적출한 조직으로 H&E 염색을 하여 뇌손상을 형태학적으로 관찰하였다. 세포배양 및 동물실험에서 NMDA 수용체의 아단위인 NR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 결 과 : 저산소군에서 세포 생존률은 정상산소군보다 60% 감소하였으며, rHuEPO 투여군(1, 10 IU/mL)은 80% 증가하였다. rHuEPO 투여군(100 IU/mL)은 회복되지 않았다. 우측 반구 대비 좌측 반구의 범위는 정상산소군 98.9%, sham-operated군 99.1%, 저산소-허헐성군 57.1%, 저산소-허헐성+vehicle군 57.0%, 저산소-허헐성 손상 전 rHuEPO 투여군 87.6%, 저산소-허헐성 손상 후 rHuEPO 투여군 91.6%으로 나타났다. NMDA 수용체의 아단위 생체외 실험에서 실시간 중합효소연쇄반응의 결과 NMDA 수용체 아단위 mRNA의 발현은 rHuEPO 투여군에서 저산소군보다 모두 증가하였다. 결 론 : 본 연구에서 rHuEPO은 흥분성 독성작용과 관련되어 NMDA 수용체를 조절하면서 저산소성 허헐성 뇌손상을 보호하는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제60권6호
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• pp.181-188
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• 2017

Purpose: Hypoxic-ischemic encephalopathy is a significant cause of neonatal morbidity and mortality. Erythropoietin (EPO) is emerging as a therapeutic candidate for neuroprotection. Therefore, this study was designed to determine the neuroprotective role of recombinant human EPO (rHuEPO) and the possible mechanisms by which mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway including extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2), JNK, and p38 MAPK is modulated in cultured cortical neuronal cells and astrocytes. Methods: Primary neuronal cells and astrocytes were prepared from cortices of ICR mouse embryos and divided into the normoxic, hypoxia (H), and hypoxia-pretreated with EPO (H+EPO) groups. The phosphorylation of MAPK pathway was quantified using western blot, and the apoptosis was assessed by caspase-3 measurement and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay. Results: All MAPK pathway signals were activated by hypoxia in the neuronal cells and astrocytes (P<0.05). In the neuronal cells, phosphorylation of ERK-1/-2 and apoptosis were significantly decreased in the H+EPO group at 15 hours after hypoxia (P<0.05). In the astrocytes, phosphorylation of ERK-1/-2, p38 MAPK, and apoptosis was reduced in the H+EPO group at 15 hours after hypoxia (P<0.05). Conclusion: Pretreatment with rHuEPO exerts neuroprotective effects against hypoxic injury reducing apoptosis by caspase-dependent mechanisms. Pathologic, persistent ERK activation after hypoxic injury may be attenuateed by pretreatment with EPO supporting that EPO may regulate apoptosis by affecting ERK pathways.

• Neonatal Medicine
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• 제18권1호
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• pp.59-69
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• 2011

목적: 6-cyano-7-nitroquinoxalin-2,3-dione (CNQX)는 저산소성허혈성뇌병증, 외상성뇌손상, 흥분독성과 같은 뇌 손상동물 모델에서 보호 효과가 있다고 발표되고 있지만 신생아기에 그 효과에 대해서는 아직 제한적이다. 저자들은 CNQX를 이용하여 저산소성허혈성뇌손상을 동반한 발달 과정에 있는 흰쥐 뇌에 산화질소합성효소 중재를 통한 뇌 보호 효과를 알아보고자 하였다. 방법: 생체내 실험으로 생후 7일된 신생 흰쥐의 좌측 총 경동맥을 결찰한 후 6개군(정상산소군, 수술없이 저산소군, sham수술 후 저산소군, 수술 후 저산소군, vehicle 투여 후 저산소군, CNQX 투여 후 저산소군)으로 나누었고, 저산소 손상은 특별히 제작한 통속에서 2시간 동안 8% $O_2$에 노출시켰다. CNQX은 뇌손상 전 30분에 체중 kg당 10 mg를 투여하였다. 생체외 실험으로 재태기간 18일된 태아 백서의 대뇌피질 세포를 배양하여 정상산소군은 5% $CO_2$ 배양기(95% air, 5% $CO_2$)에 두었고, 저산소군과 뇌손상 전 CNQX 투여군(10 ${\mu}g$/mL)은 1% $O_2$). 배양기(94% $N_2$, 5% $CO_2$)에서 16시간동안 뇌세포손상을 유도하였다. 생체내 외 실험 모두 산화질소합성효소와 관련된 iNOS, eNOS, nNOS 항체와 primer를 이용하여 western blotting과 실시간중합효소연쇄반응을 시행하였다. 결과: 산화질소합성효소와 관련된 생체외 내 실험에서 iNOS와 eNOS의 발현은 저산소군에서 정상산소군보다 감소하였으나 CNQX 투여군에서는 저산소군보다 증가하였다. nNOS의 발현은 반대로 표현되었다. 결론: 본 연구에서 CNQX는 산화질소합성효소 중재를 통하여 주산기 저산소성 허혈성 뇌손상에서 신경보호 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제52권5호
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• pp.594-602
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• 2009

목 적 : $TGF-{\beta}1$는 흥분독성을 억제시키고 질소 산화물 생성 억제를 통한 신경세포 보호 효과가 있다고 알려져 있지만 주산기저산소 허혈 뇌손상에서 그 기전은 아직도 확실히 밝혀져 있지 않고 있다. 따라서 이번 연구에서는 신생 백서의 저산소 허혈 뇌손상에서 산화질소로 인한 신경독성 및 글루탐산염에 의한 흥분독성과 $TGF-{\beta}1$의 관계를 보고자 하였다. 방 법 : 생체외 실험으로 재태 기간 19일된 태아 백서의 대뇌피질 세포를 배양하여 1% O2 배양기에서 저산소 상태로 뇌세포손상을 유도하여 저산소군(Hypoxia), 저산소 손상 30분 전 $TGF-{\beta}1$ (1, 5, 10 ng/mL) 투여군(H+$TGF-{\beta}1$)으로 나누어 정상 산소군 (Control)과 비교하였다. 생체 내 실험은 생후 7일된 백서의 좌측 총 경동맥을 결찰한 후 저산소 (7.5% O2) 상태로 2시간 노출시켜서, 저산소 허혈 뇌손상을 유발하였다. 아무런 처치도 하지 않은 정상 대조군(Control), 경동맥 노출 후 봉합 시술만 시행한 정상 Sham 수술군(Sham-OP), 손상 30분 전 생리식염수를 주입 후 경동맥 결찰과 저산소 노출을 시행한 저산소 허혈 대조군(HI+ Vehicle), 손상 30분 전 $TGF-{\beta}1$을 대뇌로 투여하고 경동맥 결찰과 저산소 노출을 시행한 저산소 허혈 $TGF-{\beta}1$ 투여군(HI+$TGF-{\beta}1$)으로 나누어 비교분석하였다. 흥분독성과의 관련을 알아보기 위하여 NMDA 수용체 아단위를 이용하였고, 질소산화물과의 관련을 알아보기 위해 iNOS, eNOS 및 nNOS를 이용하여 western blotting과 실시간 중합효소연쇄반응을 하였다. 결 과 : 생체 외 실험에서 iNOS의 발현은 정상 산소군과 저산소군 간에 차이가 없었으며, $TGF-{\beta}1$ 투여군에서는 발현이 증가하였으며 이는 농도와는 상관성이 없었다. eNOS, nNOS의 발현은 1 ng/mL의 $TGF-{\beta}1$ 투여군에서 저산소군보다 감소하였다. 생체 내 실험에서는 iNOS와 iNOS mRNA의 발현은 $TGF-{\beta}1$ 투여한 후 저산소 대조군보다 증가하였다. eNOS와 nNOS 발현은 정상 대조군 보다 저산소 대조군에서 감소하였고, eNOS의 발현은 $TGF-{\beta}1$ 투여군에서 증가하였지만 nNOS의 발현은 증가하지 않아 통계적 유의성이 없었다. eNOS mRNA와 nNOS mRNA의 발현은 iNOS와 반대로 $TGF-{\beta}1$ 투여군에서 저산소 대조군보다 감소하였다. NMDA 수용체 아단위 mRNA의 발현은 정상 대조군과 Sham 수술군에 비해 저산소 대조군에서 모두 감소하였으나 $TGF-{\beta}1$ 투여군에서 NR2C를 제외한 나머지 아단위의 발현은 저산소 대조군보다 증가하였다. 결 론 : 신생백서의 저산소 허혈 뇌손상에서 $TGF-{\beta}1$ 치료군에서 저산소로 인하여 감소된 NMDA 수용체 아단위의 발현을 증가시켜 흥분독성 기전과 관련성을 보이며, 증가된 iNOS 발현을 감소시키고 감소된 eNOS 발현을 증가시키는 질소 산화물 중재를 통한 뇌 보호 작용에 연관이 있을 것으로 생각된다.

• Toxicological Research
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• 제13권4호
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• pp.359-365
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• 1997

Many factors are known to be responsible for cerebral ischemic injury, such as excitatory neurotransmitters, increased intraneuronal calcium, or disturbance of cellular energy metabolism. Recently, oxygen free radicals, formed during ischemia/reperfusion, have been proposed as one of the main causes of ischemia/reperfusion injury. Therefore, to investigate the role of oxygen free radical during ischemia/reperfusion, in the present study the effect of endogenous oxygen free radical scavenger, superoxide dismutase / catalase(SOD / catalase) on the release of [$^3$H]-5-hydroxytryptamine([$^3$H]-5-HT) during hypoxia/reoxygenation in rat hippocampal slices was measured. The hippocampus was obtained from the rat brain and sliced 400 gm thickness with manual chopper. After 30 min's preincubation in the normal buffer, the slices were incubated for 20 min in a buffer containing [$^3$H]-5-HT(0.1 $\mu$M, 74 $\mu$Ci) for uptake, and washed. To measure the release of [$^3$H]-5-HT into the buffer, the incubation medium was drained off and refilled every ten minutes through a sequence of 14 tubes. Induction of hypoxia for 20 min (gassing it with 95% N$_2$/5% CO$_2$) was done in the 6th and 7th tube, and oxygen free radical scavenger, SOD / catalase was added 10 minutes prior to induction of hypoxia. The radioactivity in each buffer and the tissue were counted using liquid scintillation counter and the results were expressed as a percentage of the total activity. When slices were exposed to hypoxia for 20 min, [$^3$H]-5-HT release was markedly decreased and a rebound release of [$^3$H]-5-HT was observed on the post-hypoxic reoxygenation period. SOD / catalase did not changed the release of [$^3$H]-5-HT in control group, but inhibited the decrease of [$^3$H]-5-HT release in hypoxic period and rebound increase of [$^3$H]-5-HT in reoxygenation period. This result suggest that superoxide anion may play a role in the hypoxic-, and reoxygenation-induced change of [$^3$H]-5-HT release in rat hippocampal slices.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제51권10호
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• pp.1102-1111
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• 2008

목 적: Resveratrol은 주로 포도나무의 과실이나 잎 부위에서 추출되는 성분으로, 주로 심질환에서 암 예방 효과, 항염증 효과, 항산화 효과의 기능이 밝혀지고 있다. 최근 성인에 대한 신경보호 효과가 있는 것으로 알려졌지만. 신생아에서 연구는 아직까지 없다. 그래서 본 연구에서는 resveratrol이 신생 백서의 저 산소 허혈 뇌손상에서 신경보호 효과가 있는지를 알아보고자 실험하였다. 방 법: 재태기간 18일된 태아 백서의 대뇌피질 세포를 배양하여 1% $O_2$ 배양기에서 저 산소 상태로 뇌세포손상을 유도하여 저 산소군, 저 산소 30분 전 resveratrol 투여군 (1, 10, $30{\mu}g/mL$)으로 나누어 정상 산소군과 비교하였다. 또한, 동물 모델에서는 생후 7일된 백서의 좌측 총 경동맥을 결찰한 후 저 산소 (8% $O_2$) 상태로 2.5시간 노출시켜서 저 산소 허혈 뇌 손상을 유발하였고, 뇌손상 전후 30분에 resveratrol을 체중 kg당 30 mg을 복막내로 투여하였다. 세포사멸사의 관련을 알아보기 위해 Bcl-2, Bax, caspase-3 primer를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응과 동일 항체를 이용한 Western blotting을 시행하였다. 결 과: 태아 백서 뇌세포 배양 실험에서 저 산소군의 경우 Bcl-2의 발현이 정상 산소군에 비해 감소하였고, Bax의 발현과 caspase-3의 발현, 그리고 Bax/Bcl-2의 비율은 증가하였다. Reaveratrol을 투여한 실험군의 경우에서는 Bcl-2 발현은 증가하였고, Bax의 발현과 caspase-3의 발현, Bax/Bcl-2의 비율은 저 산소군에 비하여 감소하는 결과를 보였다. 또한 이는 저 산소 허혈 뇌손상 동물 모델에서도 같은 결과를 보였다. 결론: 본 연구에서 resveratrol은 주산기 저 산소 허혈 뇌손상에서 세포사멸사 작용의 억제를 통하여 신경보호 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제50권7호
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• pp.686-693
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• 2007

목 적 : Mycophenolate mofetil (MMF)의 활성 대사산물인 (MPA는 IMPDH의 잠재적인 반응 억제제로써 새로운 면역치료제로 사용되고 있다. 이러한 MPA는 신경계에서 흥분독성 손상 후 뇌세포를 보호하고, 미세아교세포에서는 세포사멸사(apoptosis)를 유도하지만, 저산소성 허혈성 뇌질환에서 MPA의 효과는 아직 알려지지 않아, 본 연구에서 Rice-Vannucci 모델을 이용한 신생 백서의 저산소성 허혈성 뇌 손상과 저산소 상태의 태아 백서 뇌세포 배양에서 MPA의 뇌보호 효과를 알아보고자 실험하였다. 방 법 : 생후 7일된 백서의 좌측 총 경동맥을 결찰한 후 저산소 (8% $O_2$) 상태에서 2시간 노출하여, 저산소성 허혈성 뇌 손상을 유발하고 뇌 손상 전후에 MPA(10 mg/kg)를 투여하여 대조군과 비교하였다. 또한, 재태기간 18일된 태아 백서의 대뇌피질 세포를 배양하여 1% $O_2$ 배양기에서 저산소 상태로 세포손상을 유도하여 저산소군, 손상 전후 MPA 투여군($10{\mu}g/mL$)으로 나누어 정상산소군과 비교하였다. 세포사멸사와의 관련을 알아보기 위해서 Bcl-2, Bax, caspase-3 항체로 western blotting하였고 Bcl-2, Bax, caspase-3 primer를 이용하여 real-time PCR을 하였다. 결 과 : 형태학적으로 H&E 염색상 MPA를 투여한 군에서 뇌 보호 효과를 보였다. Western blotting과 real-time PCR을 이용한 저산소성 허혈성 뇌손상 동물 모델뿐만 아니라 저산소 상태로 태아 백서 뇌세포 배양 실험에서도 MPA 투여한 경우 caspase-3의 발현과 Bax/Bcl-2의 비율이 감소함을 보였다. 결 론 : 본 연구에서 MPA가 anti-apoptosis 작용을 통하여 주산기 저산소성 허혈성 뇌 손상에 뇌보호 역할을 하는 것을 알 수 있었고 향후 신생아 저산소성 허혈성 뇌병증의 치료에 임상적 적용이 가능하리라 생각된다.

• Molecules and Cells
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• 제22권1호
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• pp.8-12
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• 2006

Neuron-derived orphan receptor (NOR-1) is a member of the thyroid/steroid receptor superfamily that was originally identified in forebrain neuronal cells undergoing apoptosis. In addition to apoptotic stimuli, activation of several signal transduction pathways including direct neuronal depolarization regulates the expression of NOR-1. In this study we tested whether the expression of NOR-1 is changed following transient ischemic injury in the adult rat brain. NOR-1 mRNA increased rapidly in the dentate gyrus of the hippocampal formation and piriform cortex 3 h after transient global ischemia and returned to basal level at 6 h. On the other hand, oxygen-glucose deprivation of cultured cerebral cortical neurons did not alter the expression of NOR-1. These results suggest that expression of NOR-1 is differentially regulated in different brain regions in response to globally applied brain ischemia, but that hypoxia is not sufficient to induce its expression.

• Neonatal Medicine
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• 제15권1호
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• pp.32-37
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• 2008

목 적 : 신생아 질식은 신생아 사망과 영구적 신경발달 장애의 중요한 원인이다. 이에 대한 여러 치료 방법이 시도되어 왔으나 현재까지 임상에 적용 가능한 치료 혹은 예방법은 개발되지 못하고 있다. 산모의 고열은 신생뇌에 악영향을 미치는 것으로 알려져 왔으나 최근 동물에서 시행한 고온 전처치가 뇌손상을 예방한다는 상반된 효과가 보고된 바 있다. 이에 저자들은 신생 동물의 저산소 허혈 뇌손상에 있어서의 고온 전처치의 효과를 조사하고자 이 연구를 시행하였다. 방 법 : 신생쥐를 사용하여 생후 6일에 이들을 두 군으로 나누어 전처지군은 $40^{\circ}C$의 고온 환경에, 대조군은 상온에 2시간 노출시켰다. 24시간 후 두 군 모두 편측 온목동맥 결찰 후 산소 농도 8%의 저산소 환경에 2시간 노출시켜 저산소 허혈을 유도하였으며 저산소 허혈후 7일에 뇌를 적출하여 뇌손상 정도를 비교하였다. 결 과 : 고온 전처치군 16례 중 5례(31.2%)에서 뇌손상이 관찰되어 대조군(17례 중 11례, 64.7%)에 비해 유의성 있게 뇌손상 빈도가 낮았다(P<0.05). 뇌피질, 해마, striatum 및 시상에서 관찰한 손상 부위의 분포 양상과 손상 정도는 전처치군과 대조군 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 결 론 : 신생쥐에 있어서 2시간의 고온 전처치는 저산소 허혈 뇌손상의 빈도를 감소시켰다. 이는 산모의 발열이 저산소 허혈 뇌손상 보호 효과를 나타낼 가능성을 시사하나 임상 적용에 앞서 다양한 환경 온도 및 장시간의 노출 시간으로 그 효과와 안정성에 대한 연구가 계속되어야 할 것으로 생각된다.

• Clinical and Experimental Pediatrics
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• 제52권12호
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• pp.1337-1347
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• 2009

목 적:타우린은 술폰 기를 산기로 하는 황 아미노산의 일종이며 뇌, 망막, 심장, 근육에 많이 분포되어 있다. 최근 국소적 뇌허혈에 대한 타우린의 신경보호효과에 관한 연구들이 발표되고 있으나 대부분 연구가 성인의 뇌졸중의 치료에 대한 연구이며 신생아시기의 저산소성 손상에 대한 효과를 구체적으로 연구한 바가 없다. 본 연구에서는 타우린이 저산소 상태로 유발된 뇌세포 배양과 신생 백서의 저산소성 허혈성 뇌손상에서 항세포사멸사를 통한 뇌보호 효과가 있는지를 알아보고자 실험하였다. 방 법:재태기간 18일된 태아 흰쥐의 대뇌피질 세포를 배양하여 1% $O_2$ 배양기에서 저산소 상태로 뇌세포 손상을 유도하여 저산소군, 손상 전 후 타우린 투여군($30{\mu}g/mL$)으로 나누어 정상산소군과 비교하였다. 세포사멸사와 관련을 알아보기 위해 Bcl-2, Bax, caspase-3 primer와 항체로 실시간 중합효소연쇄반응과 western blotting을 하였다. 또한, 생후 7일된 백서의 좌측 총 경동맥을 결찰한 후 저산소(8% $O_2$) 상태로 2시간 노출시켜서, 저산소성 허혈성 뇌 손상을 유발하였고, 뇌손상 전 후 30분에 타우린을 체중 kg당 30 mg을 투여하였다. 저산소성 허혈성 뇌손상 후 1일, 3일, 1주, 2주, 4주 째 뇌를 적출하여 Bcl-2, Bax, caspase-3 primer를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 하였고, 동일 항체로 western blotting하였다. 결 과:저산소로 유발된 뇌세포 배양에서 정상군에 비해 저산소군에서 뇌세포 손상이 많았고 저산소 손상전 타우린 투여군에서 뇌세포 손상이 회복되었으며 저산소 손상 후 타우린 투여군에서는 저산소 손상 전 투여군보다 회복력이 떨어졌다. 실시간 중합효소연쇄반응과 western blotting을 이용한 저산소 상태의 태아 백서 뇌세포 배양 실험뿐만 아니라 저산소성 허혈성 뇌손상 동물 모델에서도 타우린을 투여한 경우 Bcl-2의 발현은 증가하고, Bax/Bcl-2의 비율, Bax와 caspase-3의 발현은 감소함을 보였다. 결 론:본 연구에서 타우린은 주산기 저산소성 허혈성 뇌손상에서 Bcl-2 발현 감소, Bax와 caspase-3 발현 증가를 유발시켜 항 세포사멸사 기전을 통한 신경보호 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 그리고 이것은 저산소 손상 후 1주와 2주째에 가장 효과가 있었다.