• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제29권4호
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• pp.741-748
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• 2008

We have studied the folding mechanism of $\beta$ -hairpins in the proteins 1GB1, 3AIT and 1A2P by conducting unfolding simulations at moderately high temperatures. The analysis of trajectories obtained from molecular dynamics simulations in explicit aqueous solution suggests that the positions of the hydrophobic core residues lead to subtle differences in the details of folding dynamics. However, the folding of three different hairpins can be explained by a unified mechanism that is a blend of the hydrogen-bond-centric and the hydrophobiccentric models. The initial stage of $\beta$-hairpin folding involves various partially folded intermediate structures which are stabilized by both the van der Waals interactions of hydrophobic core residues and the electrostatic interactions of non-native hydrogen bonds. The native structure is obtained by forming native contacts in the final tune-up process. Depending on the relative positions of the hydrophobic residues, the actual mechanism of hairpi n folding may or may not exhibit well-defined intermediates.

• 대한화학회지
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• 제63권6호
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• pp.427-434
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• 2019

단백질 폴딩 연구에 유용하도록 유비퀴틴 단백질의 페닐알라닌 45를 트립토판으로, 발린 26을 알라닌으로 변이시킨 HubWA 단백질을 모델로 삼아 소수성 상호작용이 단백질 폴딩 반응에 끼치는 영향을 탐구하였다. HubWA의 소수성 아미노산 중 14 개를 알라닌으로 치환한 변이 단백질을 제조하였고 이들 중 폴딩 연구에 적절한 4 개의 변이 단백질(V5A, I13A, V17A, I36A)을 얻어서 폴딩 반응의 진행 과정을 stopped-flow 장치로 측정하였다. 변이 단백질 V17A의 폴딩 반응은 HubWA와 마찬가지로 three-state 메커니즘을 따르며, V5A, I13A, I36A의 반응은 two-state 폴딩 메커니즘을 따르는 것으로 관찰되었다. 이는 HubWA 단백질의 폴딩 반응은 지엽적으로 구조적인 안정성을 지닌 부분이 존재하는 중간 단계가 먼저 형성된 다음 이들이 서로 퍼즐을 맞추는 것과 같은 방식으로 폴딩이 일어나는 collision-diffusion 메커니즘을 따르다가 소수성이 약한 아미노산으로 치환하였을 때 구조적인 안정성을 지닌 중간 단계가 관찰되지 않지만 폴딩 핵의 형성과 핵 주위로 native 구조가 형성되는 반응이 짝지어서 일어나는 nucleation-condensation 메커니즘으로 전환되는 것으로 해석되었다. 이러한 관찰은 단백질의 폴딩 경로는 지엽적인 구조의 안정성에 따라 서로 다른 메커니즘을 띨 수 있음을 시사한다.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제31권10호
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• pp.2877-2883
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• 2010

The folding kinetics of $WT^*$ ubiquitin variant with valine to alanine mutation at sequence position 26 (HubWA) was studied by stopped-flow fluorescence spectroscopy. While unfolding kinetics showed a single exponential phase, refolding reaction showed three exponential phases. The semi-logarithmic plot of urea concentration vs. rate constant for the first phase showed v-shape pattern while the second phase showed v-shape with roll-over effect at low urea concentration. The rate constant and the amplitude of the third phase were constant throughout the urea concentrations, suggesting that this phase represents parallel process due to the configurational isomerization. Interestingly, the first and second phases appeared to be coupled since the amplitude of the second phase increased at the expense of the amplitude of the first phase in increasing urea concentrations. This observation together with the roll-over effect in the second folding phase indicates the presence of intermediate state during the folding reaction of HubWA. Quantitative analysis of Hub-WA folding kinetics indicated that this intermediate state is on the folding pathway. Folding kinetics measurement of a mutant HubWA with hydrophobic core residue mutation, Val to Ala at residue position 17, suggested that the intermediate state has significant amount of native interactions, supporting the interpretation that the intermediate is on the folding pathway. It is considered that HubWA is a useful model protein to study the contribution of residues to protein folding process using folding kinetics measurements in conjunction with protein engineering.

• 대한화학회지
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• 제67권2호
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• pp.81-88
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• 2023

HubWA 단백질을 모델로 삼아 소수성 아미노산이 folding 반응에 끼치는 영향을 탐색하기 위하여 HubWA에 있는 I와 L을 V로 치환한 변이 단백질의 folding kinetics를 측정하였다. 변이 단백질의 folding kinetics는 HubWA 단백질과 마찬가지로 three-state on-pathway mechanism(U ⇌ I ⇌ N, U는 unfolded 상태, I는 중간단계, N은 native 상태를 의미한다)을 따르는 것으로 나타났다. Folding kinetics 분석을 통하여 three-state 반응의 elementary 반응과 전체 반응의 자유에너지인 ΔG^o_UI, ΔG^o_IN, ΔG^o_UN을 얻었고, 변이 단백질의 자유에너지와 HubWA 단백질의 자유에너지의 차(ΔΔG^o_UI = ΔG^o_UI(변이 단백질) - ΔG^o_UI(HubWA), ΔΔG^o_UN = ΔG^o_UN(변이 단백질) - ΔG^o_UN(HubWA))의 비인 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN를 통하여 중간단계가 전체 folding 반응에 끼치는 영향을 각 소수성 잔기 별로 알아볼 수 있었다. HubWA의 입체구조에서 α-helix와 β-sheet가 상호작용하는 소수성 코어에 위치하는 아미노산인 I3, I13, L15, I30, L43, I61, L67을 V로 치환한 변이 단백질의 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN 값이 ~0.5로 나타난 점은 이들 아미노산이 중간단계에서 native 상태보다는 느슨하지만 비교적 견고한 구조를 이루는 것으로 해석되었다. HubWA 입체구조에서 α-helix의 아미노말단에 위치하는 I23, 특정 이차구조가 없는 부위에 위치하는 I36, β-strand 5의 카복실말단에 위치하는 L69를 V로 치환한 변이 단백질의 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN 값이 0.4 이하로 나타난 것은 이들 아미노산 잔기가 중간단계에서는 비교적 느슨한 구조를 이루다 중간단계에서 native 단계로 진행하는 folding 과정의 후반부에 HubWA의 입체구조에 견고하게 편입되는 것으로 해석되었다. HubWA의 입체구조에서 두 번째 β-strand의 카복실말단에 위치한 V17, 짧은 네 번째 β-strand의 카복실말단에 위치한 L50, 짧은 3₁₀-helix의 아미노말단에 위치한 L56이 중간단계에서 서로 상호작용을 하는 점은 이들 아미노산을 V로 치환한 변이 단백질의 ΔΔG^o_UI/ΔΔG^o_UN값이 0.8 이상으로 나타난 점을 통하여 알 수 있었다. L50과 L56은 짧은 β-strand와 3₁₀-helix를 제외하고 특별한 이차구조가 존재하지 않는 부위(46번째 아미노산 잔기부터 62번째 아미노산 잔기 까지)에 위치하는데, 이들 아미노산이 V17과 더불어 folding 반응의 초기에 견고하게 상호작용을 하는 것은 HubWA단백질이 folding 과정의 초기에 응집체를 형성하는 것을 막아주는 역할을하는 것으로 생각되었다.

• BMB Reports
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• 제44권2호
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• pp.102-106
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• 2011

Thermodynamic stability and refolding kinetics of firefly luciferase and three representative mutants with depletion of negative charge on a flexible loop via substitution of Glu by Arg (ER mutant) or Lys (EK mutant) as well as insertion of another Arg in ER mutants (ERR mutant) was investigated. According to thermodynamic studies, structural stability of ERR and ER mutants are enhanced compared to WT protein, whereas, these mutants become prone to aggregation at higher temperatures. Accordingly, it was concluded that enhanced structural stability of mutants depends on more compactness of folded state, whereas aggregation at higher temperatures in mutants is due to weakening of intermolecular repulsive electrostatic interactions and increase of intermolecular hydrophobic interactions. Kinetic results indicate that early events of protein folding are accelerated in mutants.