Hepatitis C virus (HCV) is known as the causative agent of blood transmitted hepatitis. Two viral proteins, E2 and NS5A, are known to exert interferon resistance of HCV via PKR pathway. Here, we report a third protein, the RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) of HCV, induced interferon resistance inhibiting p56 pathway. p56 was shown to interact with p48 subunit of eukaryotic initiation factor 3 (eIF3). This interaction inhibited formation of ternary complex in translation initiation. Using dual reporter assay system, we observed that the translation decreased when interferon alpha was added to the culture. But, in the presence of HCV NS5B, the translation partly recovered. NS5B and p48 subunit of eIF3 were shown to interact. This interaction seems to inhibit the interaction between p48 and p56. This is the first report that a virus exerts interferon resistance via p56 pathway.
The hepatitis C virus is associated with the development of liver cirrhosis and hepatocellular carcinomas. Among the 10 polyproteins produced by the virus, no function has been clearly assigned to the non-structural 5A (NS5A) protein. This study was designed to identify the hepatocellular proteins that interact with NS5A of the HCV. Yeast two-hybrid experiments were performed with a human liver cDNA prey-library, using five different NS5A derivatives as baits, the full-length NS5A (NS5A-F, amino acid (aa) 1~447) and its four different derivatives, denoted as NS5A-A (aa 1~150), -B (aa 1~300), -C (aa 300~447) and D (aa 150~447). NS5A-F, NS5A-B and NS5A-C gave two, two and 10 candidate clones, respectively, including an AHNAK-related protein, the secreted frizzled-related protein 4 (SFRP4), the N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1), the cellular retinoic acid binding protein 1 (CRABP-1), ferritin heavy chain (FTH1), translokin, tumor-associated calcium signal transducer 2 (TACSTD2), phosphatidylinositol 4-kinase (PI4K) and $centaurin{\delta}$ 2 ($CENT{\delta}2$). However, NS5A-A produced no candidates and NS5A-D was not suitable as bait due to transcriptional activity. Based on an in vitro binding assay, CRABP-1, PI4K, $CENT{\delta}2$ and two unknown fusion proteins with maltose binding protein (MBP), were confirmed to interact with the glutathione S-transferase (GST)/NS5A fusion protein. Furthermore, the interactions of CRABP-1, PI4K and $CENT{\delta}2$ were not related to the PXXP motif (class II), as judged by a domain analysis. While their biological relevance is under investigation, the results contribute to a better understanding of the possible role of NS5A in hepatocellular signaling pathways.
Choi, Jae-Woong;Kim, Jong-Wook;Nguyen, Lap P.;Nguyen, Huu C.;Park, Eun-Mee;Choi, Dong Hwa;Han, Kang Min;Kang, Sang Min;Tark, Dongseob;Lim, Yun-Sook;Hwang, Soon B.
Molecules and Cells
/
제43권5호
/
pp.469-478
/
2020
Hepatitis C virus (HCV) propagation is highly dependent on cellular proteins. To identify the host factors involved in HCV propagation, we previously performed protein microarray assays and identified the LIM and SH3 domain protein 1 (LASP-1) as an HCV NS5A-interacting partner. LASP-1 plays an important role in the regulation of cell proliferation, migration, and protein-protein interactions. Alteration of LASP-1 expression has been implicated in hepatocellular carcinoma. However, the functional involvement of LASP-1 in HCV propagation and HCV-induced pathogenesis has not been elucidated. Here, we first verified the protein interaction of NS5A and LASP-1 by both in vitro pulldown and coimmunoprecipitation assays. We further showed that NS5A and LASP-1 were colocalized in the cytoplasm of HCV infected cells. NS5A interacted with LASP-1 through the proline motif in domain I of NS5A and the tryptophan residue in the SH3 domain of LASP-1. Knockdown of LASP1 increased HCV replication in both HCV-infected cells and HCV subgenomic replicon cells. LASP-1 negatively regulated viral propagation and thereby overexpression of LASP-1 decreased HCV replication. Moreover, HCV propagation was decreased by wild-type LASP-1 but not by an NS5A binding-defective mutant of LASP-1. We further demonstrated that LASP-1 was involved in the replication stage of the HCV life cycle. Importantly, LASP-1 expression levels were increased in persistently infected cells with HCV. These data suggest that HCV modulates LASP-1 via NS5A in order to regulate virion levels and maintain a persistent infection.
Lim, Yun-Sook;Nguyen, Men T.N.;Pham, Thuy X.;Huynh, Trang T.X.;Park, Eun-Mee;Choi, Dong Hwa;Kang, Sang Min;Tark, Dongseob;Hwang, Soon B.
Molecules and Cells
/
제45권3호
/
pp.148-157
/
2022
Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease and is highly dependent on cellular proteins for viral propagation. Using protein microarray analysis, we identified 90 cellular proteins as HCV nonstructural 5A (NS5A) interacting partners, and selected telomere length regulation protein (TEN1) for further study. TEN1 forms a heterotrimeric complex with CTC and STN1, which is essential for telomere protection and maintenance. Telomere length decreases in patients with active HCV, chronic liver disease, and hepatocellular carcinoma. However, the molecular mechanism of telomere length shortening in HCV-associated disease is largely unknown. In the present study, protein interactions between NS5A and TEN1 were confirmed by immunoprecipitation assays. Silencing of TEN1 reduced both viral RNA and protein expression levels of HCV, while ectopic expression of the siRNA-resistant TEN1 recovered the viral protein level, suggesting that TEN1 was specifically required for HCV propagation. Importantly, we found that TEN1 is re-localized from the nucleus to the cytoplasm in HCV-infected cells. These data suggest that HCV exploits TEN1 to promote viral propagation and that telomere protection is compromised in HCV-infected cells. Overall, our findings provide mechanistic insight into the telomere shortening in HCV-infected cells.
We examined the hepatitis G virus infections among 227 Koreans who were healthy or were suspected of hepatitis and determined the phylogenetic relationship based on a part of the NS-5 region of 5 positive samples. Viral RNA was extracted from sera and cDNA was synthesized and subsequently amplified by RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) or RT-nested PCR using random hexamer and NS-5 specific primers (470-20-1-77F, 470-20-1-211R, HGVNESTFO, HGVNESTRE). Five positives were found to belong to samples of patients showing symptoms of viral hepatitis. Primers used for PCR or nested PCR were derived from the NS-5 region. On the other hand, no amplification was detected using primers derived from the 5'-NCR (G-146F, G-401R). We performed TA cloning and sequencing of 5 amplified fragments, and their sequences were compared with those of foreign isolates of HGV. The phylogenetic analysis using MegAlign programme of DNAstar has shown that the Korean isolates are clustered on the phylogenetic tree. In summary, we confirmed the hepatitis G virus infection in 5 cases out of 12 patients showing the symptoms of viral hepatitis. The phylogenetic analysis of sequences of 5 amplified fragments showed that their relations to each other were closer than those to the foreign HGV isolates reported.
Hepatitis C virus (HCV) has been considered as a mojor causative agent of post-transfusion related non-A, non-B hepatitis. In this study, the cDNA sequence of NS4 region of HCV (HCV-S) obtained from a Korean patient's plasms was determined. Comparative nucleotide sequence analysis between to type II. 67.2% homology to type III, and 66.4% homology to type IV. The putative amino acid sequence homologies to types I, II, III, and IV were 82.8-84.7%, 92.5-95.1%. 72.5, and 71.1%, respectively. This data strongly suggests that HCV-S should be classified as type II. Significant similarities of hydrophobicity profiles and putative transmembranous domains were found in HCV-S and four major prototypes, indicating that the protein structure is similar in spite of the heterogeneities of intertype homologies at the level of the psrimary nucleotide and amino acid sequences.
Kim, Jung-Hee;Rhee, Jin-Kyu;Ahn, Dae-Gyun;Kim, Kwang Pyo;Oh, Jong-Won
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
제24권12호
/
pp.1744-1754
/
2014
The hepatitis C virus (HCV) RNA genome is replicated by an RNA replicase complex (RC) consisting of cellular proteins and viral nonstructural (NS) proteins, including NS5B, an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) and key enzyme for viral RNA genome replication. The HCV RC is known to be associated with an intracellular membrane structure, but the cellular components of the RC and their roles in the formation of the HCV RC have not been well characterized. In this study, we took a proteomic approach to identify stomatin, a member of the integral proteins of lipid rafts, as a cellular protein interacting with HCV NS5B. Co-immunoprecipitation and co-localization studies confirmed the interaction between stomatin and NS5B. We demonstrated that the subcellular fraction containing viral NS proteins and stomatin displays RdRp activity. Membrane flotation assays with the HCV genome replication-competent subcellular fraction revealed that the HCV RdRp and stomatin are associated with the lipid raft-like domain of membranous structures. Stomatin silencing by RNA interference led to the release of NS5B from the detergent-resistant membrane, thereby inhibiting HCV replication in both HCV subgenomic replicon-harboring cells and HCV-infected cells. Our results identify stomatin as a cellular protein that plays a role in the formation of an enzymatically active HCV RC on a detergent-resistant membrane structure.
The nonstructural protein 5B (NS5B) of hepatitis C virus (HCV) is the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), which is the essential catalytic enzyme for the viral replication and is an appealing target for the development of new therapeutic agents against HCV infection. A small amount of serum from a single patient with hepatitis C was used to get the genome of a Korean HCV isolate. Sequence analysis of NS5B 1701 nucleotides showed the genotype of a Korean isolate to be subtype 1b. The soluble recombinant HCV NS5B polymerase lacking the C-terminal 24 amino acids was expressed and purified to homogeneity. With the highly purified NS5B protein, we established in vitro systems for RdRp activity to identify potential polymerase inhibitors. The rhodanine family compounds were found to be potent and specific inhibitors of NS5B from high throughput screening (HTS) assay utilizing the scintillation proximity assay (SPA) system. The binding mode of an inhibitor was analyzed by measuring various kinetic parameters. Lineweaver-Burk plots of the inhibitor suggested it binds not to the active site of NS5B polymerase, but to an allosteric site of the enzyme. The activity of NS5B in in vitro polymerase reactions with homopolymeric RNA requires interaction with multiple substrates that include a template/primer and ribonucleotide triphosphate. Steady-state kinetic parameter, such as Km, was determined for the ribonucleotide triphosphate. One of compounds found interacts directly with the viral polymerase and inhibits RNA synthesis in a manner noncompetitively with respect to UTP. Furthermore, we also investigated the ability of the compound to inhibit NS5B-directed viral RNA replication using the Huh7 cell-based HCV replicon system. The investigation is potentially very useful for the utility of such compounds as anti-hepatitic agents.
The nonstructural protein 5A (NS5A) encoded by the human hepatitis C virus (HCV) RNA genome is a multifunctional phosphoprotein. To analyse the influence of NS5A on apoptosis, we established an Hep-NS5A cell line (HepG2 cells that stably express NS5A) and induced apoptosis using tumour necrosis factor $(TNF)-{\alpha}$. We utilised the MTT assay to detect cell viability, real-time quantitative polymerase chain reaction and Western blot to analyse gene and protein expression, and a luciferase reporter gene experiment to investigate the targeted regulatory relationship. Chromatin immunoprecipitation was used to identify the combination of $NF-{\kappa}B$ and miR-503. We found that overexpression of NS5A inhibited $TNF-{\alpha}$-induced hepatocellular apoptosis via regulating miR-503 expression. The cell viability of the $TNF-{\alpha}$ induced Hep-mock cells was significantly less than the viability of the $TNF-{\alpha}$ induced Hep-NS5A cells, which demonstrates that NS5A inhibited $TNF-{\alpha}$-induced HepG2 cell apoptosis. Under $TNF-{\alpha}$ treatment, miR-503 expression was decreased and cell viability and B-cell lymphoma 2 (bcl-2) expression were increased in the Hep-NS5A cells. Moreover, the luciferase reporter gene experiment verified that bcl-2 was a direct target of miR-503, NS5A inhibited $TNF{\alpha}$-induced $NF-{\kappa}B$ activation and $NF-{\kappa}B$ regulated miR-503 transcription by combining with the miR-503 promoter. After the Hep-NS5A cells were transfected with miR-503 mimics, the data indicated that the mimics could reverse $TNF-{\alpha}$-induced cell apoptosis and blc-2 expression. Collectively, our findings suggest a possible molecular mechanism that may contribute to HCV treatment in which NS5A inhibits $NF-{\kappa}B$ activation to decrease miR-503 expression and increase bcl-2 expression, which leads to a decrease in hepatocellular apoptosis.
A method of dual-signal generation from two different enzymes was developed and utilized to simultaneously perform dual immunoassays in a single microwell. Two enzymes selected as tracers were horseradish peroxidase (HRP) and β-galactosidase (GAL). 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine (TMB) and chlorophenolred-β-galactopyranoside (CPRG) as chromogenic substrates for the respective enzyme were used. Although the two enzymes showed their maximum activities at distinct pH conditions (pH 5.1 for HRP and 7.5 for GAL), the enzyme reactions were able to be concurrently carried out at pH 5.75 in a dual-substrate solution without signal loss. This performance was achieved by increasing TMB concentration two-fold, introducing potassium salt as activator of GAL reaction, and extending total reaction time 50%. The signal generation method was then used for dual-enzyme immunoassays to detect antibodies with co-immobilized Hepatitis C virus antigens (core and NS5) and a Hepatitis B virus antigen (PreS(2)) in a microwell. Dose-response curves of the assays revealed cooperativity between different antigen-antibody complex formation, which suggested that dual immunoassays can only be used for qualitative screening tests unless the antigens immobilized were spatially separated.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.