The Great Sebkha of Oran is a closed depression located in northwestern of Algeria. Despite the ranking of this sebkha among the wetlands of global importance by Ramsar Convention in 2002, no studies on the fungal community in this area have been carried out. In our study, samples were collected from two different regions. The first region is characterized by halophilic vegetation and cereal crops and the second by a total absence of vegetation. The isolated strains were identified morphologically then by molecular analysis. The biotechnological interest of the strains was evaluated by testing their ability to grow at different concentration of NaCl and to produce extracellular enzymes (i.e., lipase, amylase, protease, and cellulase) on solid medium. The results showed that the soil of sebkha is alkaline, with the exception of the soil of cereal crops that is neutral, and extremely saline. In this work, the species Gymnoascus halophilus, Trichoderma gamsii, the two phytopathogenic fungi, Fusarium brachygibbosum and Penicillium allii, and the teleomorphic form of P. longicatenatum observed for the first time in this species, were isolated for the first time in Algeria. The halotolerance test revealed that the majority of the isolated are halotolerant. Wallemia sp. and two strains of G. halophilus are the only obligate halophilic strains. All strains are capable to secrete at least one of the four tested enzymes. The most interesting species presenting the highest enzymatic index were Aspergillus sp. strain A4, Chaetomium sp. strain H1, P. vinaceum, G. halophilus, Wallemia sp. and Ustilago cynodontis.
발효가 진행중인 멸치액젓에서 단백질분해효소를 생산하는 3종의 호염성 세균을 분리하였다. 분리된 FAM 10, FAM 114, 그리고 FAM 115는 각각 소금농도가 2~4%, 10%, 6%에서 최적 세포성장이 관찰되었으며, 18~22% 소 금농도까지 생육이 가능했다. 단백질분해효소 생산을 위한 최적 소금농도는 FAM 10은 6%, FAM 114와 FAM 115는 10%로 나타났다. FAM 10의 단백질분해효소 활성은 10%까지 첨가하면 서서히 저하되며, 14% 소금농도에서는 효소활성이 없는 반면, FAM 114와 FAM 115의 경우, 14%까지 효소활성을 나타냈으며 18%에서는 활성을 관찰할 수 없었다. 이러한 결과로부터 분리된 3종의 미생물이 중간 정도의 호염성 세균임을 증명하였다. 16S rRNA 유전자와 16S-23S 유전자 사이 공간(IGS) 서열, 생화학적 실험, 그람염색을 이용하여 비교 분석한 결과, FAM 10, FAM 114, 그리고 FAM 115는 각각 Salinivibrio sp., Halobacillus sp., 그리고 Halobacillus sp.임을 동정하였다. Salinivibrio sp. FAM 10에는 191번째 서열부터 약간 다른 2가지 종류의 16S rDNA와 16S-23S IGS내에 tRNA 유전자가 없는 형태, 이소루이신/알라닌, 글루탐산/라이신/발린을 운반하는 tRNA 유전자들을 함유하는 4가지 종류의 다른 16S-23S IGS가 존재하였다. Hablobacillus sp. FAM 114와 FAM 115는 완전히 동일한 16S rRNA 유전자 서열을 가지고 있었으며, 여러 Halobacillus sp.와 99% 서열동일성을 보여주었다. IGS의 경우, tRNA 유전자가 없는 IGS와 이소루이신/알라닌을 운반하는 tRNA 유전자들을 함유하는 3가지 16S-23S IGS가 존재하였으며, Halobacillus aidingensis와 Halobacillus sp. JM-Hb의 IGS와 99% 서열동일성을 보여주었다.
다섯 종류의 젓갈로부터 다섯 종의 호염성 세균을 분리하였다. 이들의 165-rDNA 염기서열을 분석한 결과 한 종은 Halomonas subglaciescola, 다른 종들은 H. marina에 속하는 것으로 판명되었다. H. subglaciescola, H. marina IN, and H. marina SH-2는 염도가 $3\%$에서 $20\%$에 이르는 넓은 범위의 배양 조건에서, H. marina SQ and H. marina SH-1는 염도가 $8\%$$19\%$에 이르는 비교적 좁은 범위의 배양 조건에서 성장하는 것으로 나타났다. $15\%$ NaCl을 포함하는 LB 배지에서 배양한 H. subglaciescola, H. marina IN, H. marina SQ, H. marina SH-1, H. marina SH-2의 최대 균체량은 흡광도로서 각각 3.2, 4.5, 4.5, 5.7, 4.2 이었으나 $5\%$의 NaCl을 포함하는 동일 배지에서 최대 균체량은 각각 2.2, 1.1, 0.7, 0.2, 2.4 이었다. 균체의 주사전자현미경 사진에서 균체의 표면에 부정형의 이물질이 부착되 어 있는 것으로 확인되었다. 각 균체의 배양액에서 점성을 갖는 물질을 분리하여 대장균의 배양액에 첨가하였을 때 대장균은 $15\%$ NaCl을 갖는 배지에서 성장하였다. 이것은 호염균의 세포 표면에 부착한 물질이 NaCl의 차단효과를 갖기 때문으로 생각된다.
오징어 젓갈로 부터 분리한 protease를 생산하는 H5-2 균주는 Halobacterium 속 균으로 동정되었으며 NaCl 2.0M 이하의 배지에서는 생육하지 못하는 고도 호염성균이었고, 이 균의 protease 생산은 Nan 4.5M, yeast extract 0.4%, gelatin 1.5%를 첨가한 pH7.0의 Norberg & Hofsten 배지에서 $38^{\circ}C$로 $4{\sim}5$일간 배양했을 때 가장 양호하였다.
Intracellular enzymes of an extreme halophilic bacterium, Halobacterium sp. HE10, isolated from a saltern in Korea was investigated. The membrane-bound enzyme, NADH dehydrogenase, involved in electron transport system was stimulated by the addition of 2.0 M NaCl. The respiratory enzyme activities such as NADH oxidase and NADH dehydrogenase was decreased on removal of $Na^+$ ion and restored when replaced with cations like $K^+$, $Li^+$and $NH_{4}^{+}$ ions. Furthermore, their activities were affected by the anions such like carbonate, acetate, sulfate, chloride and nitrate at the presence of $Na^+$ion. Lactate dehydrogenase activity was highest at the asturated solution of NaCl and isocitrate dehydrogenase activity was a maximum level at 1.0 M NaCl. These results suggested that the enzyme activites of the respiratory chain in Halobacterium sp. EH10 was stimulated by the presence of $Na^+$ ion.
천일염으로 부터의 $10\%$ NaCl 농도에서 생육할 수 있는 moderate 호염성 세균들을 대상으로하여 간단한 boiling 법으로 plasmid 유전자를 함유하는 6종을 선별하여 Alkaline-Lysis 법과 고분자 plasmid 추출법인 D. Portnoy & F. White 방법에 따라 plasmid를 추출하여 agarose gel 전기영동으로 확인하였고 각 균을 동정하였다. 그중 Vibrio sp. 14는 최소 7.2kbp, Alcaligenes sp.63은 6.4 kbp, Pseudomonas sp.11은 6.35 kbp, Flavohacterium sp.38은 8.5 kbp, Bacillus sp.16은 8.75 kbp, Alcaligenes sp.52는 6.8kbp 크기의 plasmid를 가지고 있는 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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