• 원예과학기술지
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• 제18권5호
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• pp.594-598
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• 2000

본 실험은 형질전환 담배내에서의 배유 특이 promoter에 의한 gus 유전자의 조직 특이적 발현 여부와 전이유전자의 후대로의 유전 양상을 확인하고자 수행하였다. 배유 특이 promoter에 의해 유도되는 gus 유전자(Z4pro-gus)와 kanamycin 저항성유전자를 운반하는 BV3 construct를 A. tumerfaciens을 이용하여 담배 형질전환체를 유기시켰다. 형질전환체 중에서 8개체를 선발하여 nptII primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과 8개체 모두에서 700bp의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. Promoter에 따른 유전자의 발현양상을 알아보기 위하여 Z4pro-gus가 전이된 형질전환체의 잎과 CaMV35S와 gus 유전자(35Spro-gus)로 구성된 pBI121 construct를 전이시킨 형질전환체의 잎으로부터의 발색정도를 비교하였다. 그 결과 Z4pro-gus가 전이된 형질전환체의 경우 잎에서 매우 부분적으로 극소량 발색되었으나 35Spro-gus가 전이된 형질전환체의 잎에서는 상대적으로 많은 양의 발색정도를 보여 promoter에 따른 발현정도의 차이를 보였다. 보다 명확한 Z4 promoter의 조직 특이 발현 양상을 확인하기 위하여 Z4pro-gus로 형질전환시킨 $T_0$ 식물체를 자가수분하여 얻은 $R_1$ 종자와 35Spro-gus를 형질전환시켜 같은 방법으로 얻은 $R_1$ 종자를 histochemical assay하였다. 그 결과 35Spro-gus로 형질전환된 담배 종자는 절단면 전체에서 gus 유전자가 발현되어 배유뿐만 아니라 종자 내 다른 조직에서도 발색되는 양상을 나타내었으나 Z4pro-gus를 형질전환 시켜 얻은 종자의 경우는 배유 부분만이 조직 특이적으로 파랗게 발색되었고 배 또는 그 이외의 조직에서는 gus 발색이 전혀 관찰되지 않았다. Kanamycin 저항성검정을 실시한 결과 모든 계통에서 전이유전자가 후대로 안정적으로 전이됨을 확인할 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제31권3호
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• pp.185-190
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• 2004

Agrobacterium을 이용한 GUS 유전자를 효과적으로 발현시키기 위하여 수행되어진 실험 결과를 요약하면 다음과 같다. 박테이라 농도별 실험을 수행한 결과 균의 전처리 배양 농도 O $D_{600nm}$ 0.3일때 원심분리한 후 얻어진 균을 희석한 후의 최종 농도는 O $D_{600nm}$ 0.8로 맞춘 실험 처리구에서 GUS 유전자 발현율이55%로 가장 높게 나타났다. 병원성 유도 배지 내에 Acetosyringone (AS)이 첨가되지 않은 경우 GUS 유전자가 발현된 고추 잎을 얻을 수 없었으나, 200$\mu$M을 첨가했을 때 90%의 가장 높은 GUS 유전자 발현율을 나타내어 많은 수의 GUS spots을 관찰할 수 있었다. Agrobacterium에 의한 고추 잎의 감염 정도를 조사한 바 Agrobacterium으로 감염시킨지 3일째부터는 박테리아 에한 감염 정도가 심해져서 GUS 유전자 발현 정도가 약해지므로 Agrobacterium으로 감염시킨지 2일째 되었을 때 GUS 유전자 발현이 가장 강하게 나타난 것을 확인하였다. 이 같은 결과는 박테리아에 의한 감염이 일어난지 3일째 부터는 식물체의 감염부위 고사를 일으키는 것과 관련된 것으로 보인다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권2호
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• pp.89-93
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• 1998

Tomato phenylalanine ammonia-lyase 5 (tPAL5) was identified that alternate initiation sites were utilized differentially in response to environmental stimuli (Lee et al, 1992b). In this study, we tried to look into tissue -or cell- specific expression pattern of tPAL5 gene by fusing with ${\beta}-glucuronidase$ (GUS) gene in transgenic tobacco plants. In transgenic plants, root and stem extracts contained 8~12 fold higher levels of GUS activity than petiole or leaf tissue while the highest levels of induction was observed from leaf tissue by mechanical wounding (5~11 fold). In trans-sections of stems and petioles, GUS activity was restricted to phloem cells(outer region) of developing vascular bundle and mainly at apical tip region in the root tissues. The levels of GUS activity was drastically reduced (10~12 fold reduction) when the 5'-upstream region of tPAL5 gene (-1151bp from ATG codon) was deleted up to -665. The levels of GUS expression, however, raised up by 6~8 fold when deleted up to -455. Therefore, we conclude that there are positive cis-elements at the region -1151 to -1008 and at -455 to -195 while the negative cis-element is at -1008 to -455.

• Plant Biotechnology Reports
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• 제2권4호
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• pp.267-270
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• 2008

We have successfully used the low-pressure BioWare gene gun, developed for gene transfer in animal cells, for plant tissues. The BioWare device is easy to manipulate. Just 50 psi helium pressure was sufficient to transfer foreign genes into the aleurone layer and embryo of maize without causing tissue damage in the impact area. As shown by expression signals from invasive histochemical ${\beta}-glucuronidase$ (GUS) activity, the foreign reporter gene expressed well in bombarded tissues. This successful GUS-transient expression extends the application of this low-pressure gene gun from animal cells to plant tissues.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제2권3호
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• pp.135-142
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• 2000

The activity of promoter sequences was evaluated in garlic cells using the $\beta$-glucuronidase (GUS) gene as a reporter. Histochemical GUS assay indicated transient GUS activity in leaf, callus and root cells 48 hours after particle bombardment transformation. Quantitative fluorometric assays in extracts of transformed leaves demonstrated that the CsVMV promoter induced the highest level of gene expression, which was, on average, ten fold the level induced by CaMV35S and by the Arabidopsis Act2 promoters and two fold the level expression observed with a construct containing a double CaMV35S plus the untranslated leader sequence from AMV. No activity or very low levels were observed when cells were transformed with plasmids rontaining the typical monocot promoters, Actl, from rice or the Ubi-1, from maize. The green fluorescent protein (GFP) was also tested as a marker gene for garlic transformation. Intense fluorescence was observed in leaf, callus and root cells transformed with a construct containing the gfp gene under control of the CaMV35 Promoter. No fluorescence was detected when the gfp was under control of the Ubi-1 promoter.

• Journal of Crop Science and Biotechnology
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• 제10권1호
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• pp.50-56
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• 2007

Barley S-adenosylmethionine synthetase1 gene, which was differentially expressed in seed development of extra early barley, was regulated by the phytohormones and abiotic stresses. In order to identify the regulation regions which were involved in transcriptional control of the phytohormones and abiotic stresses, we isolated 1459 bp fragment of HvSAMS1 gene promoter using genome walking strategy and deletion series were constructed. Deleted upstream fragments(-1459, -1223, -999, -766, -545, -301 bp) were fused to the GUS reporter gene and evaluated via Agrobacterium-mediated transient expression assay. Increased GUS activity of HvSMAS1 promoter -301/GUS construct under each of NaCl, $GA_3$, ABA and ethylene application was found. However, GUS activity was negligible in the leaves transformed with the HvSMAS1 promoter(-1459, -1223, -999, -766 and -545)/GUS constructs. No significant induction of GUS activity was observed for the ethionine and spermidine treatments. In order to locate promoter sequence of the HvSAMS1 gene that was critical for the activation of gene expression, deletion and addition promoter derivatives(+, includes 43 bp of 5' ORF) of the HvSAMS1 gene fused to the GUS reporter gene were applied. The tobacco leaves which harbored the additional HvSAMS1 promoter(-1459+, -1459 to -546, -545+ and -301+)/GUS construct did not significantly induce GUS activity as compared to the HvSAMS1 promoter(-1459, -545 and -301)/GUS constructs under each of NaCl, ABA and $GA_3$ treatment. However, the GUS activity was high in the tobacco leaves which harboring the -211 to -141 regions of the HvSAMS1 promoter. This result suggested that HvSAMS1 gene expression might be regulated by this region(from -211 to -141).

• 식물조직배양학회지
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• 제21권1호
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• pp.55-58
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• 1994

Agrobacterium-based vector를 이용하여 상추를 형질전환 및 재분화 하였다. 즉 $C_{a}$ MV 35S promoter와 GUS 유전자를 reporter로 가지고 있는 pBl121을 Agrobacterium tmfaciens LBA4404에 도입시킨 후 상추의 자엽 절편과 cocultivation을 통하여 형질전환 시키고 재분화 시켰다. Southern 및 Northern 분석을 통하여 형질 전환 및 재분화된 상추에 GUS 유전자가 안정하게 도입되고 식물체내에서 mRNA로 발현됨을 확인하였다. 또한 GUS 유전자가 식물 체내에서 단백질로 발현됨을 확인하기 위하여 상추 잎의 단백질 추출액을 이용하여 분광분석법에 의하여 GUS의 활성을 측정하였다. 시료간의 약간의 차이는 있으나 시료로부터 유의적인 GUS 활성을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제37권4호
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• pp.511-516
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• 2010

아그로박테리움 매개에 의한 형질전환 기술을 이용하여 국내에서 육성된 품종 'Sweet Yellow'로부터 유도된 체세포배 (배발생캘러스 포함)로 intron-GUS유전자가 전이된 식물체를 획득하기까지의 과정이 제시되었다. Intron-GUS 유전자를 포함하고 있는 Agrobacterium tumefaciens AgL1(O.D=0.7~1.6)에 30분 감염시켜 3일간 공동배양 한 후 $4^{\circ}C$에서 7일간의 저온처리를 거친 후 cefotaxim $250\;mg{\cdot}L^{-1}$ 첨가 체세포배발아 배지에 배양된 체세포배 (배발생캘러스 포함)들 대부분으로 유전자가 전이된 것을 GUS transient assay에 의해 확인하였다. Intron-GUS유전자가 전이된 체세포배 (배발생캘러스 포함)로부터 신초원기를 유도한 후 신초를 재분화시켰고, 재분화된 신초로부터 다신초가 형성되도록 하였다. 다신초로부터 신초의 일부를 떼어 GUS transient assay 분석을 실시하여 intron-GUS 유전자의 발현을 확인한 후 발근시켜 순화 후 온실로 옮겼다. GUS transient assay에 의해 확인된 유전자 발현율은 100%였다.

• 한국자원식물학회지
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• 제10권2호
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• pp.107-113
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• 1997

화이트 클로버의 배축, 잎, 미숙배 유래의 embryogenic callus에 식물 binary vector인 pBI121을 포함하는 A. tumefaciens LBA4404를 접종하여 효과적으로 화이트 클로버를 형질전환시켰다. A. tumefaciens를 이용한 화이트 클로버의 형질전환은 acetosyringone을 사용함으로써 품종간의 차이가 없이 배발생 캘러스에서 16-19%를 보였다. 재분화 식물체의 PCR 및 Northern 분서글 통하여 형질 전환된 화이트 클로버의 염색체내에 GUS 유전자가 안정되게 도입되었고 식물체내에서 mRAN로 발현됨을 확인하였다. 또한, GUS 유전자가 식물체내에서 단백질로 발현됨을 확인하기 위하여 형질 전환되어진 화이트 클로버부터 단백질을 추출하고 분광분석법에 의하여 GUS의 활성을 측정하였으며, 시료간에 약간의 차이는 있으나 유의적인 GUS 활성을 확인하였다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제21권3호
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• pp.288-292
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• 2005

Pathogenesis-related protein-1a (PR-1a) is strongly induced in tobacco plants by pathogen attack, exogenous salicylic acid (SA) application and by other developmental processes. In order to develop a rapid screening system for the selection of plant defense-inducing compounds originated from various sources, we have transformed tobacco Samsun NN plants with a chimeric construct consisting of GUS $(\beta-glucuronidase)$. In the $T_1$ generation, three transgenic lines having stable GUS expression were selected for further promoter analysis. Using GUS histochemical assay, we observed strong GUS induction driven by PR-1a promoter in PR1a-GUS transgenic tobacco leaves in response to the exogenous application of SA or benzol (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH), a SA­derivative compound. In addition, GUS expression was maintained locally or systemically in PR1a-GUS transgenic line $\#5\;T_2$ generation) until after 3 days when they were treated with same chemicals. Our results suggested that the PR1a-GUS reporter gene system in tobacco plants may be applicable for the large-scale screening of defense-inducing substances.