본 연구에서는 상황버섯의 수용성 추출물을 이용하여 PPAECs 세포의 발아에 미치는 효과 및 그 작용기작을 알아보고자 하였다. 상황버섯 추출물을 $10{\sim}50{\mu}g/mL$ 농도로 처리하면 PPAECs 세포의 발아가 약 $38{\sim}58%$ 억제되었으나, $200{\sim}400{\mu}g/mL$ 처리군에서는 약 $1.42{\sim}1.47$배의 발아 증가를 유도하였다. PPAECs 세포에 상황버섯 추출물을 처리한 결과, MMP-2는 상황버섯 추출물 농도 $50{\mu}g/mL$까지는 약 30% 정도 분비가 억제되다가 $100{\mu}g/mL$에서부터 증가하기 시작하여 $400{\mu}g/mL$에서는 약 1.7배의 MMP-2 분비 증가 효과를 나타냈다. 이에 비해 MMP-9의 분비는 농도-의존적으로 감소되었으며, MMP-3는 $50{\sim}400{\mu}g/mL$에서 약 $1.5{\sim}1.7$배의 분비 증가 고과를 보였다. 또한 $100{\sim}200{\mu}g/mL$ 농도의 상황버섯 추출물에서 피브린 젤의 용해 및 MMP-2의 활성화에 관여하는 플라스민의 분비증가가 약 2.4배 유도되었다. 한편 상황버섯 추출물 처리시 고농도($100{\sim}400{\mu}g/mL$)에서 PPAECs 세포의 발아가 촉진되었으며, 이러한 효과는 MMPs 및 플라스민 억제제에 의해 약 $40{\sim}44%$ 억제되어 피브린 젤에서 확인된 상황버섯 추출물에 의한 발아 증가는 MMPs 및 플라스민의 분비증가에 의한 것이라 사료된다.
Vascular endothelial growth factor (VEGF)와 hepatocyte growth factor (HGF)는 강력한 혈관신생 유도인자로 알려져 있다. 세포가 이동하고 침윤하기 위해서는 세포의 증식과 더불어 주변의 세포외기질을 분해하는 단백질분해효소의 분비가 선행되어야 한다. 본 연구에서는 인간의 악성신경교종 유래 세포주인 U-373-MG 세포에 VEGF와 HGF를 처리하여 세포의 증식, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2)와 MMP-9 및 플라스민의 분비, 세포의 이동 및 침윤에 미치는 효과를 조사하였다. 또한 단백질분해효소 억제제 처리를 통하여 세포의 증식, 이동 및 침윤에 미치는 단백질분해효소의 역할을 조사하였다. 연구 결과, VEGF와 HGF의 병용처리 시 VEGF와 HGF의 단독 처리 시보다 세포의 증식, MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비, 세포의 이동 및 침윤이 유의할만하게 증가되었다. 한편 VEGF와 HGF 처리에 의한 U-373-MG 세포의 증식, 이동 및 침윤 증가에 미치는 단백질분해효소의 효과를 MMPs 억제제인 BB-94를 처리하여 조사한 결과 최대 이동 효과를 나타낸 HGF와 VEGF의 병용처리군 보다 세포의 이동이 32% 억제되었고 플라스민 억제제인 α2AP에 의해서도 29% 억제되었다. 또한 U-373-MG 세포의 침윤 역시 BB-94와 α2AP 처리에 의해 유의할 만하게 억제되었다. 이러한 결과는 VEGF와 HGF에 의한 MMP-2, MMP-9 및 플라스민의 분비증가에 의해 직접 또는 간접적인 경로를 통하여 U-373-MG 세포의 증식, 이동 및 침윤을 증가시킨다고 여겨진다.
인천 연안의 심하게 오염된 갯벌로부터 강력한 세포외 알카리성 단백질 분해효소를 생산하는 호알카리성 Bacillus clausii I-52를 분리하였으며, 이 균주로부터 알카리성 단백질 분해효소의 유전자를 cloning하여 서열 분석을 하였다. Chromosome 서열이 완전히 밝혀진 Bacillus subtilis의 서열을 기초로 하여 알카리성 단백질 분해효소 및 promoter를 포함하도록 primer를 고안하여 PCR을 수행하여 2,277 bp의 DNA 단편을 얻었으며 BLAST 분석 결과 29 개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 77 개의 아미노산으로 이루어진 propeptide 및 275 개의 아미노산을 갖는 활성형의 BCAP으로 구성된 총 381 개의 아미노산을 코딩하는 1,143 bp의 open reading frame을 확인하였다. 활성형 BCAP의 N-말단 아미노산은 Ala이며, 분자량 및 pI 값은 각각 27698.7 Da과 6.30으로 계산되었다. 아미노산 상동성을 분석한 결과, B. subtilis 유래의 nattokinase precursor 및 B. subtilis BSn5 유래의 subtilisin E precursor와 99%의 서열 상동성을 나타내어 B. clausii I-52 유래의 BCAP은 subtilisin 계열의 단백질 분해효소임을 확인하였다. E. coli BL21(DE3)에서 발현한 재조합 BCAP는 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 를 효율적으로 분해하였다. Refolding한 재조합 BCAP은 전형적인 serine protease inhibitor인 PMSF에 의하여 강하게 효소 활성이 억제됨으로써 serine protease 계열의 단백질 분해효소임을 알 수 있었다.
세포 사멸은 항상성을 유지하기 위해 세포군을 조절하는 중요한 메커니즘이며 시스테인 단백질분해효소 중 하나인 카스파제는 세포 사멸 경로의 중요한 중재자이다. Caspase-8은 세포외 자극에 의해 시작되는 외인성 세포자멸 경로의 개시자 카스파제이다. Caspase-8에는 보존된 도메인인 N-말단의 두개의 죽음 이펙터 도메인(DED)과 C-말단의 2개의 촉매 도메인을 가지며, 이는 이러한 외인성 세포자멸 경로에 중요하게 작용한다. 외인성 세포멸사 경로에서, TNF 슈퍼패밀리인 죽음 수용체는 세포 외부로부터의 죽음 수용체 특이적 리간드의 결합에 의해 활성화된다. 활성화된 죽음 수용체가 어댑터 단백질인 Fas-associated death domain 단백질(FADD)을 모집한 후, 죽음 수용체와 FADD의 죽음 도메인(DD)이 서로 결합하고 죽음 수용체와 결합한 FADD가 caspase-8의 전구체 형태인 procaspase-8을 모집한다. FADD와 procaspase-8의 죽음 이펙터 도메인은 서로 결합하고 FADD에 결합된 procaspase-8은 prodomain의 절단에 의해 활성화된다. 이 죽음 수용체-FADD-caspase-8 복합체는 세포사멸 유도 신호복합체(DISC)라고 한다. 세포 FLICE 억제 단백질(c-FLIPs)은 세포사멸을 억제하는 역할과 촉진하는 역할을 모두 수행하여 caspase-8의 활성화를 조절하고 caspase-8 활성화는 caspase-3와 같은 작동자 카스파제를 활성화를 시킨다. 마지막으로 활성화된 작동자 카스파제는 DNA 분해, 핵 응축, 세포막 수포 및 카스파제 기질의 단백질 분해에 작용하여 세포사멸을 완료한다.
연구배경 :임상적으로 만성 기관지염 환자의 호흡기 증상이 급격히 악화되는 것으로 정의되는 만성 기관지염의 급성악화는 기도의 폐쇄를 조장하여 만성 폐쇄성 폐질환으로의 진행을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 방 법 :만성 기관지염의 급성악화 환자 40명을 대상으로 하였으며 대상 환자를 무작위로 moxifloxacin군과 clarithromycin군으로 나누어 항생제를 경구투여 하였다.항생제를 복용 하기 전과 항생제를 7일간 복용한 후 각각 객담을 유도 처리하여 유도객담 상층액 내의 IL-8, SLPI, MMP-1, MMP-9, TIMP-1의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. 결 과 : 항생제 투여에 의해 유도객담 내 TIMP-l의 농도와 TIMP-1/MMP-1의 분자량 비율이 유의하게 감소하였고 (p<0.05), 유도객담 내 SLPI의 농도는 유의하게 증가하였다(p<0.01) 급성악화 시 유도객담 내의 TIMP-1의 농도(p<0.01, r=0.751)와 TIMP-l/MMP-1의 분자량 비율(p<0.01, r=0.752)은 IL-8과 유의한 상관관계를 보이고 있었으며 항생제 치료로 호전이 된 이후에도 IL-8과의 상관관계는 계속 관찰되었다. 급성악화 시 유도객담 내 SLPI의 농도는 유도객담 내 TIMP-1(p<0.01, r=-0.496)과 TIMP-1/MMP-1(p<0.01, r=-0.456)의 분자량 비율 변화와 유약한 상관관계가 있었다. 그러나 유도객담 내 MMP-1, MMP-9의 농도 그리고 TIMP-l/MMP-9의 분자량 비율은 IL-8이나 SLPI의 농도와 유의한 상관관계가 없었다. 결 론 : 만성 기관지염의 급성 악화에 의해 TIMP와 MMPs의 불균형이 초래되며 TIMP가 상대적으로 많이 증가함으로써 기도 내 ECM이 축적되는데 적절한 항생제를 사용하지 않았을 때에는 이러한 기도벽의 재구성이 반복되어 기도의 폐쇄가 심해질 것으로 생각된다. TIMP와 MMPs의 불균형은 항생제 치료에 의하여 호전이 됨으로 적절한 항생제 치료는 만성 기관지염의 급성악화에 의한 비가역성 기도 폐쇄가 진행되는 것을 어느 정도 예방할 수 있을 것으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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