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Thiazole 또는 Pyrazine유도성 Microsomal Epoxide Hydrolase의 순수정제: Epoxide Hydrolase-관련성 43 kDa 단백질의 유도증가 (Purification of Thiazole- and Pyrazine-inducible Microsomal Epoxide Hydrolase: Induction of Epoxide Hydrolase-related Novel 43 kDa Protein)

  • 김상건
    • 대한약리학회지
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    • 제29권2호
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    • pp.275-282
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    • 1993
  • Microsomal epoxide hydrolase (mEH)은 epoxide형 중간대사물을 해독화하는 효소이다. 본 실험실에서는 thiazole 또는 pyrazine을 rat에 투여할 때 mEH mRNA수준이 증가되고 mEH가 유도증가한다는 것을 밝힌바 있다(Carcinogenesis, Kim et al, 1993). 본 연구에서는 Thiazole처리를 한 rat의 간 microsome 분획으로 부터 DEAE-cellulose column chromatography를 이용하여 mEH를 순수분리하였고, 이를 SDS-PAGE분석 및 N 말단 amino acid 서열분석으로 확인하였다. Pyrazine처리를 한 rat의 간 microsome분획에서는 mEH와 더불어 이와 관련된 43 kDa 단백질이 함께 정제되었다. 정제된 thiazole 유도성 mEH를 토끼에 주사하여 항체를 생산하였고, 이 항체를 이용한 immunoblot 분석을 하였을 때 간 microsome 분획의 mEH가 thiazole투여군에서는 대조군에 비하여 10배, pyrazine 투여군에서 7배 증가하였다. Pyrazine처치한 rat의 간 microsome 분획에서는 mEH 관련성 43 kDa 단백질이 동시 유도증가하는 것을 면역화학적 반응으로도 확인하였다. 이때 Pyrazine으로 유도된 rat의 간 microsome 분획 또는 정제분획에 존재하는 43 kDa 단백질과 mEH의 비율은 1 : 15로 나타났다. 정제된 mEH와 43 kDa 단백질의 N 말단 amino acid 서열을 분석하였을때 43 kDa 단백질의 N 말단이 mEH와 동일하게 나타나 관련 단백질임을 확인하였다. 이러한 mEN 유도현상에 종차가 있는지를 알아보기 위하여 thiazole과 pyrazine을 각각 rabbit에 투여하였을 때 rabbit에서 는 mEH의 유도증가가 일어나지 않았으며, pyrazine 투여군에서 43 kDa 단백질의 증가는 관찰 되었다. 본 연구는 thiazole 또는 pyrazine 투여후 mEH 발현이 유도증가되며, pyrazine 투여 후에는 mEH 및 이와 관련된 43 kDa 단백질이 동시유도되고, 이러한 mEH 유도발현에 rat와 rabbit간에는 종차가 있음을 보여준다.

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BDNF 유전자 이입 슈반세포와 PGA 도관을 이용한 백서 좌골신경 재생에 관한 연구 (PERIPHERAL NERVE REGENERATION USING POLYGLYCOLIC ACID CONDUIT AND BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR GENE TRANSFECTED SCHWANN CELLS IN RAT SCIATIC NERVE)

  • 최원재;안강민;고은봉;신영민;김윤태;황순정;김남열;김명진;조승우;김병수;김윤희;김성민;이종호
    • Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons
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    • 제30권6호
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    • pp.465-473
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    • 2004
  • Purpose : The essential triad for nerve regeneration is nerve conduit, supporting cell and neurotrophic factor. In order to improve the peripheral nerve regeneration, we used polyglycolic acid(PGA) tube and brain-derived neurotrophic factor(BDNF) gene transfected Schwann cells in sciatic nerve defects of SD rat. Materials and methods : Nerve conduits were made with PGA sheet and outer surface was coated with poly(lactic-co-glycolic acid) for mechanical strength and control the resorption rate. The diameter of conduit was 1.8mm and the length was 17mm Schwann cells were harvested from dorsal root ganglion(DRG) of SD rat aged 1 day. Schwann cells were cultured on the PGA sheet to test the biocompatibility adhesion of Schwann cell. Human BDNF gene was obtained from cDNA library and amplified using PCR. BDNF gene was inserted into E1 deleted region of adenovirus shuttle vector, pAACCMVpARS. BDNF-adenovirus was multiplied in 293 cells and purified. The BDNF-Adenovirus was then infected to the cultured Schwann cells. Left sciatic nerve of SD rat (250g weighing) was exposed and 14mm defects were made. After bridging the defect with PGA conduit, culture medium(MEM), Schwann cells or BDNF-Adenovirus infected Schwann cells were injected into the lumen of conduit, respectively. 12 weeks after operation, gait analysis for sciatic function index, electrophysiology and histomorphometry was performed. Results : Cultured Schwann cells were well adhered to PGA sheet. Sciatic index of BDNF transfected group was $-53.66{\pm}13.43$ which was the best among three groups. The threshold of compound action potential was between 800 to $1000{\mu}A$ in experimental groups which is about 10 times higher than normal sciatic nerve. Conduction velocity and peak voltage of action potential of BDNF group was the highest among experimental groups. The myelin thickness and axonal density of BDNF group was significantly greater than the other groups. Conclusion : BDNF gene transfected Schwann cells could regenerate the sciatic nerve gap(14mm) of rat successfully.

UVB 로부터 ROS를 유도한 제브라피쉬에 스피룰리나 에탄올 추출물의 항산화 및 보호효과에 관한 연구 (Anti-oxidative and protective effects of Arthrospira platensis ethanol extracts on zebrafish ROS Induced by UVB Induction)

  • 장덕영;한영석;양재찬;김보애
    • 한국응용과학기술학회지
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    • 제35권2호
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    • pp.423-432
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    • 2018
  • 스피룰리나는 지구상의 가장 오래된 조류중 하나이며 피코시아닌, 토코페롤, 베타카로틴을 함유하고 있어 노화를 방지한다고 보고된 바 있다. 본 연구에서는 재배방법이 다른 스피룰리나 에탄올추출물의 UVB로 유도된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 저해와 항산화효과를 확인하였다. 실내배양 스피룰리나 에탄올추출물(ICAE)과 야외배양 스피룰리나 에탄올추출물(OCAE) 0.1, 0.5, $1mg/m{\ell}$의 DPPH 라디칼 소거능과 SOD 유사 활성을 측정하여 항산화효과를 확인하였다. UVB로 유도된 ROS의 저해 효과는 제브라피쉬 배아와 HaCaT 세포를 이용하여 확인하였다. ICAE와 OCAE 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, $1mg/m{\ell}$을 제브라피쉬 배아와 HaCaT 세포에 처리하고 UVB로 ROS를 유도하였고 DCFH-DA로 염색하여 세포내 ROS의 양을 검출하였다. 항산화효과를 측정한 결과 양성대조군인 ascorbic acid의 DPPH 라디칼 소거능은 73%, SOD 유사 활성은 86%로 나타났다. ICAE와 OCAE $1mg/m{\ell}$의 농도에서 각각 43, 57%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었고, 20, 19%의 SOD 유사 활성을 나타내어 양성대조군인 ascorbic acid보다 낮았지만 유의적인 항산화효과가 있었다. UVB로 유도된 제브라피쉬 배아와 HaCaT 세포의 ROS가 음성대조군보다 증가하였고, ICAE와 OCAE 처리된 군은 농도 의존적으로 UVB만 조사된 양성대조군 보다 ROS가 감소하였다. 본 연구의 결과는 스피룰리나 에탄올추출물이 피부보호용 화장품 소재로 사용가치가 있음을 시사한다.

이마앞겉질을 제거시킨 흰쥐 앞뇌의 바닥핵무리에서 변성축삭종말의 미세구조연구 (Ultrastructure of Degenerating Axon Terminals in the Basal Forebrain Nuclei of the Rat following Prefrontal Decortication)

  • 안병준;고정식;안의태
    • Applied Microscopy
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    • 제35권3호
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    • pp.135-152
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    • 2005
  • 중추신경계통에서도 최고중추인 이마앞겉질 (prefrontal cortex)은 거의 모든 대뇌겉질과 연결되어 있어서 대뇌겉질 각 부분에 저장된 감각, 운동, 언어... 등 모든 정보를 받을 뿐만 아니라, 앞뇌의 바닥핵들 (basal forebrain nuclei)을 비롯한 많은 신경핵들과도 연결되어 있어서 생체 내부환경과 본능에 관한 정보도 받아드린다. 이들 연결을 통해서 이마앞겉질은 변연계통의 본능, 감정, 기억, 학습기능과 줄무늬체계통의 적절한 표현, 대응, 절차기억, 운동조절기능들을 연계하고 조정한다. 앞뇌의 바닥핵들(꼬리핵 caudate nucleus, 줄무늬체바닥핵 fundus striati nucleus, 중격옆핵 accumbens septi nucleus, 중격핵 septal nucleus)도 역시 변연계통과 줄무늬체계통 사이에서 해부학적으로나 기능적으로도 교차기능이 있는 것으로 알려져 있다. 이 실험은 흰쥐의 이마앞겉질은 제거한 다음, 앞쪽 앞뇌의 바닥핵들에서 변성종말들이 있는지 여부와 그 미세구조를 관찰하려고 시행했다. $250{\sim}300g$된 흰쥐를 실험동물로 이용하였으며, 흰쥐들을 정상군, 대조군, 수술군으로 구분하였다. 수술군은 마취시킨 다음, 뇌수술장치에 고정시키고, 머리피부를 절개한 다음, 이마뼈에 구멍을 만들고, 이 구멍을 통해 이마앞겉질을 흡인하여 제거했다. 대조군은 이마뼈에 구멍을 만드는 과정까지만 실행하였고, 정상군은 아무조치도 취하지 않았다. 수술 후 2일 경과 후에 전자현미경 관찰을 위해 1% glutaraldehyde-1% paraldehyde 혼합액 (pH 7.4)에 1차 고정하였고, 뇌를 적출하여 고정액에 냉장시켰다가, 다음날 해당 신경핵을 적출하여 2차 고정액 (2% osmium tetroxide액)에 고정하였다. Araldite 혼합액에 포매하여 ultratome-V로 자른 절편은 4% uranyl acetate와 2.7% lead citrate로 염색하여 JEM 100CX-II 전자현미경으로 관찰하였다. 관찰결과 네 신경핵에서 모두 변성 축삭종말이 관찰되었는데, 출현비율은 상당한 차이를 보여서 가장 변성이 심한 신경핵은 꼬리핵 이었고, 다음은 줄무늬체바닥핵, 중격옆핵, 중격핵의 순서였다. 변성축삭종말이 각 부위에서 연접하는 모양을 비교한 결과 꼬리핵과 줄무늬체바닥핵에서는 모두 가지돌기가시(dendritic spine)에 연접하였으나, 중격옆핵과 중격핵에서는 가지돌기 (dendrite)에 연접하는 것과 가지돌기가시에 연접하는 것이 혼재하였다. 이들 두 신경핵 무리는 이마앞겉질에서 기원하는 축삭종말의 연접차이로 볼 때 서로 다른 회로계통에 속할 것으로 생각되며, 문헌고찰을 통해서 꼬리핵과 줄무늬체바닥핵은 줄무늬체회로 (striatal circuit)에 속하고 중격옆핵과 중격핵은 변연계통회로(limbic circuit)에 속할 것으로 판정했다. 이마앞겉질은 생리적, 약리적, 신경학적 및 형태학적 근거들로 보아 바닥핵들을 통해 변연계통과 대뇌겉질 전체에 영향을 미칠 것으로 여겨지는데, 본 실험에서는 네 종류의 바닥핵들, 즉 꼬리핵, 줄무늬체바닥핵, 중격옆핵 및 중격핵과 관련된 신경연접들을 관찰하였으며, 그 결과를 문헌 고찰한 결과 변연계통과 줄무늬체계통이 앞뇌의 바닥에 있는 신경핵들에서 형태학적 교차연결을 통해 정서와 마음의 상태를 행동과 대응으로 표현하는 중요한 신경회로가 존재함을 제안하였다.

Saxitoxin 검출을 위한 Neuro-2a 시험법 조건 확립 및 실험실 간 변동성 비교 연구 (Establishment of Test Conditions and Interlaboratory Comparison Study of Neuro-2a Assay for Saxitoxin Detection)

  • 김영진;서주리;김준;박정인;김종희;박현;한영석;김연정
    • 한국해양생명과학회지
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    • 제9권1호
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    • pp.9-21
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    • 2024
  • 마비성 패류 독소(Paralytic shellfish poisoning, PSP)는 유해 조류에 의해 생성되며, 독소에 노출된 수산물을 섭취하였을 때 중독이 발생한다. 수산물 중 PSP를 검출하는 표준 시험법인 Mouse bioassay (MBA)는 낮은 검출한계와 동물 윤리 문제로 대체 시험법의 개발 필요성이 대두되고 있다. 이러한 대체 시험법 중, PSP가 신경 세포막의 Na+ 채널을 차단하는 기전을 이용한 마우스 뇌신경 모세포종 세포 기반 시험법(Neuro-2a assay)의 표준화를 위한 노력이 대두되고 있다. Neuro-2a assay의 원리는 Neuro-2a 세포주에 Na+/K+ ATPase 억제제인 Ouabain(O)과 Na+ 채널 활성화제인 Veratridine (V)을 처리하여 과도한 Na+ 유입으로 인한 세포사멸을 유도한 상태에서, Na+ 채널 억제제인 PSP를 처리하게 되면 Na+ 유입이 차단되어 세포가 생존하는 것을 측정하는 것이다. 본 연구에서는 PSP 검출을 위한 Neuro-2a assay를 국내 연구 환경에 맞게 다양한 매개변수를 개선하여 최적 시험법을 확립하고자 하였다. 고려한 매개변수들은 세포밀도, 배양 조건 및 PSP 처리 조건 등으로, 그 결과는 아래와 같다. 초기 세포밀도는 40,000 cells/well로, 세포 배양시간 및 처리시간은 각각 24시간으로 설정하였다. 또한 최적 O/V 농도는 500/50 μM로 설정하였다. 본 연구에서 PSP 중 Saxitoxin (STX)에 대해서 O/V 처리가 된 상태에서 S자형 용량-반응 그래프가 도출되는 8가지 농도(368~47,056 fg/μl)를 확인하였고, Neuro-2a assay의 실험실 간 변동성 비교를 통해, 실험의 적정성 확인을 위한 5가지 Quality Control Criteria와 실험 데이터의 신뢰가능 범위(Data Criteria) 6가지를 설정하였다. 확 립된 조건으로 Neuro-2a assay를 진행한 결과 반수영향농도(EC50) 값은 약 1,800~3,500 fg/μl로 나타났다. 실험실 간 변동성 비교 결과, Quality Control Criteria 값 및 Data criteria 값의 변동계수(coefficients of variation (CVs))가 1.98~29.15% 범위로 산출되어 실험의 적정성 및 재현성이 확인되었다. 본 연구를 통해 우리나라에서 활용할 수 있는 PSP 검출용 Neuro-2a assay 시험법의 최적 조건 및 5가지 Quality control 기준을 제시하였고, PSP 중 대표적인 독소인 STX을 대상으로 Neuro-2a assay를 실시한 결과 유의한 EC50 값을 산출할 수 있었으며, 향후 국내 수산물을 대상으로 MBA를 대체할 수 있는 PSP 검출법으로 활용될 것으로 기대된다.

말백합, Meretrix petechialis의 생식소 발달단계에 따른 일부 조직의 생화학적 성분 변화 (Changes in Biochemical Components of Several Tissues of the Hard Clam, Meretrix petechialis, in Relation to Gonad Developmental Phases)

  • 김용민;박관하;정의영;김종배;이창훈
    • 한국패류학회지
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    • 제22권2호
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    • pp.125-134
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    • 2006
  • 2002년 1월부터 12월까지 말백합 (Meretrix petechialis)을 대상으로 조직학적 관찰에 의해 생식주기를 조사하였고, 생화학적 분석방법에 의해 폐각근 조직과 내장낭 조직의 생화학적 성분 변화를 조사하였다. 본 종의 생식주기는 초기활성기 (1-3월), 후기활성기 (2-5월), 완숙기 (4-8월), 부분산란기 (7-8월) 그리고 퇴화 및 비활성기 (9-2월)로 연속적인 5단계로 구분할 수 있었다. 총단백질 함량은 내장낭에서 폐각근보다 약 2 배 정도 높게 나타났다. ANOVA test 결과, 총단백질 함량의 월별 변화는 폐각근에서 유의한 차이가 없었고 (p = 0.071), 내장낭에서는 유의한 차이를 보였다 (p < 0.001). 내장낭 내 단백질 함량은 초기활성기 (1-3월), 후기활성기 (3-5월), 및 완숙기에 높았고, 7월에 가장 낮았다. 글리코겐 함량은 내장낭보다 폐각근에서 더 높았다. 글리코겐 함량의 월변화는 폐각근 (F = 237.2, p < 0.001) 과 내장낭 (F = 64.04, p < 0.001) 모두에서 유의성을 나타내었다. 글리코겐 함량은 폐각근의 경우, 완숙기인 4 월에 최대치에 이른 후, 부분산란기 및 퇴화기인 6-9월까지 서서히 감소하였다. 그리고 내장낭의 경우는 초기활성기까지는 비교적 낮은 값을 보인 후, 후기활성기인 5월에 가장 높았다. RNA 함량은 폐각근보다 내장낭에서 더 높게 나타났다. RNA 함량의 월별 변화는 폐각근 (F = 195.2, p < 0.001) 과 내장낭 (F = 78.85, p < 0.001) 모두에서 유의성을 나타내었다. RNA 함량은 폐각근의 경우, 초기활성기인 1-2월에 높았고, 후기활성기인 3-4월에 극감하였으며, 완숙기인 5월에 약간 증가된 후 6-7월에 다시 감소하였다. 그리고 내장낭의 경우는 완숙기인 5월에 가장 높았고, 부분산란기인 6-7월에 급격히 그 값이 감소하였다. 총단백질 함량의 경우 폐각근과 내장낭 사이에 통계적으로 유의한 양의 상관관계가 나타났다 (r = 0.715, p = 0.020). 글리코겐의 경우에는 양의 상관관계가 있는 것처럼 나타났으나 (r = 0.216), 통계적으로 유의한 수준은 아니었다 (p = 0.550). RNA의 경우 음의 상관관계가 나타났으나(r = -0.233), 이 또한 통계적으로 유의한 수준은 아니었다 (p = 0.518). 전반적으로 볼 때, 가리비류와 같이 생식소, 소화맹낭, 중장선이 부위별로 구분이 된 이매패류와 달리 백합은 위 3가지 부분이 명확하게 구분되지 않아 내장낭으로 분석하여 특정시기(월)에 국한되어 폐각근과 내장낭의 생화학적 함량변화가 역상관관계를 나타내는 현상을 보였다. 특히, 폐각근과 내장낭내 총 RNA 함량 변화 양상은 총단백질 함량 변화 양상과 유사한 경향을 보여 RNA 함량 증가시 단백질 함량의 증가가 일어나고 있음을 알 수 있었다.

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