• 한국잡초학회지
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• 제17권1호
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• pp.44-51
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• 1997

제초제(除草除) glyphosate는 EPSP-synthase 생합성(生合成) 자체는 억제(抑制)하지 못하며 단지 효소활성(酵素活成)만을 억제한다. 이러한 억제는 뿌리 빛 줄기 정단부에서 현저했다. EPSP-synthase의 전체구(前體區) 단백질(蛋百質)은 54 kDa의 분자량(分子量)을 갖으며, 엽록체(葉綠體)내 성숙(成熟) 단백질(蛋百質)은 45kDa 정도의 분자량(分子量)을 나타낸다. Glyphosate 처리 직후(直後) 인위적 암처리(暗處理)는 EPSP-synthase의 엽록체(葉綠體)내 삽입을 완전히 억제하지 못한다. 이러한 결과는 Glyphosate에 의한 EPSP-synthase 엽록체(葉綠體)내 삽입 기작은 전적으로 광(光)의존적인 것은 아니며 오히려 광의존적 제초활성을 나타내는 glyphosate의 엽록체내 유입후 아직까지 알려지지 않은 조절기작에 의해 간접적으로 억제되는 것으로 보였다.

• 미생물학회지
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• 제33권1호
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• pp.1-6
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• 1997

5-Enolpyruvylshikimate 3-phosphate(EPSP) synthase는 방향족 아미노산을 생합성하는 shikimate phathway의 6번째 효소로 광범위 제초제인 glyphosate의 target enzyme이다. 본 연구에서는, glyphosate에 저해를 받지 않는 EPSP synthase를 개발하고자 하는 연구의 한 단계로서, 우선, EPSP synthase를 대량 발현시킬수 있는 expression vector인 pET-25b를 사용하여 발현시킨 다음, 발현된 효소가 periplasmic space로 transport되는지 또 발현된 단백질이 효소 활성을 가지고 있는지 확인하고자 하였다. 그 결과, pelB leader를 앞에 붙여 발현시킨 EPSP synthase는 periplasmic space로 제대로 transport되며, 단백질 생산 및 periplasmic space로의 수송은 induction 온도에 의해 크게 좌우된다는 것을 관찰하였다. Periplasmic space로 수송되는 EPSP synthase의 양은 $34^{\circ}C$에서 induction시켰을 때 가장 많은 것으로 나타났다. 한편, pET-25b를 이용하여 발현시킨 EPSP synthase는 C-terminal 부위에 HSV-tag, His-tag등 26개 아미노산이 더 있는 상태로 만들어지는데, His-tag은 $Ni^{2+}$-affinity chromatography를 통한 정제에, HSV-tag은 Western blotting을 통한 detection에 각각 이용할 수 있다. 또한, 이와 같이 발현된 recombinant EPSP synthase는 phosphocellulose resin에 결합하였다가 기질인 shikimate 3-phosphate와 phosphoenolpyruvate에 의해 elution되며, glyphosate에 의해 저해되는등 wildtype효소와 같은 효소 특성을 보였다.

• 한국잡초학회지
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• 제15권2호
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• pp.148-153
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• 1995

Glyphosate (N-[phosphonomethyl]glycine)를 토마토(Lycopersicon esculentum Mil)의 동화부위(同化部位)에 부분처리(部分處理)하거나 전(全) 식물체(植物體)에 분무처리(噴霧處理)하였을 때 EPSP-synthase의 활성(活性) 감소(減少)가 나타났다. EPSP-synthase의 활성(活性)은 처리된 식물체(植物體)의 엽록소(葉綠素)의 감소보다 시기적으로 먼저 나타나는 현상이었다. EPSP-synthase의 활성(活性)은 glyphosate처리(處理)에 민감한 효소(酵素)로서 토마토의 세포현탁배양조직(細胞顯濁培養組織)과 분열조직(分裂組織)간에는 활성(活性)의 차이가 없없다. EPSP-synthase의 활성은 4-6 nkat/mg protein 정도이었다. EPSP-synthase의 활성(活性)억제는 glyphosate 처리(處理) 36시간 후 부터 나타나기 시작하였고, 엽록소(葉綠素)의 감소는 처리 48 시간 후 부터 나타나기 시작하였다. 세포현탁배양(細胞顯濁培養)에서 치사농도(致死濃度) 이하(以下)에서 glyphosate는 생체중(生體重)을 저하(低下)시켰으며 생육단계(生育段階) 중 lag-phase를 연장(延長)시켜 생육(生育)이 더디도록 하였다. Glyphosate 존재(存在)하에서 생체중(生體重)은 계대(繼代)배양 후 14일이 지난 뒤에 생체중(生體重)이 최고(最高)에 달하였다. EPSP-synthase에 대한 gly-phosate의 억제(抑制)효과는 lag-phase에서 심하게 나타났다.

• Journal of Microbiology
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• 제45권2호
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• pp.153-157
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• 2007

5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSP synthase, EC 2.5.1.19) is the sixth enzyme in the shikimate pathway which is essential for the synthesis of aromatic amino acids and many secondary metabolites. The enzyme is widely involved in glyphosate tolerant transgenic plants because it is the primary target of the nonselective herbicide glyphosate. In this study, the Dunaliella salina EPSP synthase gene was cloned by RT-PCR approach. It contains an open reading frame encoding a protein of 514 amino acids with a calculated molecular weight of 54.6 KDa. The derived amino acid sequence showed high homology with other EPSP synthases. The Dunaliella salina EPSP synthase gene was expressed in Escherichia coli and the recombinant EPSP synthase were identified by functional complementation assay.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권8호
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• pp.1385-1389
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• 2007

5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase catalyzes the formation of EPSP and inorganic phosphate from shikimate-3-phosphate (S3P) and phosphoenolpyruvate (PEP) in the biosynthesis of aromatic amino acids. To delineate the domain-specific function, we successfully isolated the discontinuous C-terminal domain (residues 1-21, linkers, 240-427) of EPSP synthase (427 residues) by site-directed mutagenesis. The engineered C-terminal domains containing no linker (CTD), or with gly-gly ($CTD^{GG}$) and gly-ser-ser-gly ($CTD^{GSSG}$) linkers were purified and characterized as having distinct native-like secondary and tertiary structures. However, isothermal titration calorimetry (ITC), $^{15}N-HSQC$,\;and\;^{31}P-NMR$ revealed that neither its substrate nor inhibitor binds the isolated domain. The isolated domain maintained structural integrity, but did not function as the half of the full-length protein.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제28권12호
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• pp.2303-2309
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• 2007

Expressed protein ligation (EPL) technique, joining recombinantly expressed proteins to polypeptides, has been widely adopted for addressing various biological questions and for drug discovery. However, joining two recombinant proteins together is sometimes difficult when proteins are expressed insoluble and unrefoldable, because ligation-active proteins via intein-fusion are obtainable when they are folded correctly. We overcame this limitation coexpressing target protein with additional methionine aminopeptidase (MAP) which enhances removal of the initiation methionine of recombinantly expressed protein. Our approach demonstrated that two domains of 46 kDa 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase, a target of herbicide glyphosate, were successfully joined by native chemical ligation, although its C-terminal domain was expressed as an inclusion body. The intein-fused N-terminal fragment of EPSP synthase (EPSPSN, residues 1-237) was expressed and the ligation-active thioester tagged N-terminal fragment (EPSPSN-thioester) was purified using a chitin affinity chromatography and mercapto-ethanesulphonate (MESNA) as intein thiolysis reagent. Its Cterminal fragment (EPSPSC, residues Met237-238CYS-427), expressed as an inclusion body, was prepared from an additional MAP-expressing strain. Protein ligation was initiated by mixing ~1 mM of EPSPSN-thioester with ~2 mM of EPSPSCCYS (residues 238CYS-427). Also we found that addition of 2% thiophenol increased the ligation efficiency via thiol exchange. The ligation efficiency was ~85%. The ligated full-length EPSP synthase was dissolved in 6 M GdHCl and refolded. Circular dichroism (CD) and enzyme activity assay of the purified protein showed that the ligated enzyme has distinct secondary structure and ~115% specific activity compared to those of wild-type EPSP synthase. This work demonstrates rare example of EPL between two recombinantly expressed proteins and also provides hands-on protein engineering protocol for large proteins.

• 원예과학기술지
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• 제28권4호
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• pp.648-655
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• 2010

본 연구에서는 들잔디와 돌연변이체에서 Glyphosate 내성 관련 유전자인 EPSPS를 코딩하는 cDNA를 분리하여, 시퀸스 비교분석과 발현 양상 차이 등에 관하여 조사하였다. 5'/3' RACE를 통하여 밝혀진 EPSPS의 cDNA는 각각 1176bp의 open reading frame으로 이루어져 있으며 391개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 이는 보고된 다른 EPSPS 유전자들과 높은 유사성을 가지고 있다. Genomic southern 결과 들잔디 내에 EPSPS 유전자는 단일copy로 존재하였다. Wild type과 제초제 내성 변이체의 EPSPS 유전자는 6개의 아미노산 시퀀스의 차이를 보였으며 기존에 보고된 EPSPS active site에서 시퀀스의 차이를 나타냈다. 한편 glyphosate의 독성기작의 하나인 EPSPS 효소활성 저해 작용을 알아본 결과, 내성 개체에서 높은(1.5배 이상) EPSPS 활성을 확인할 수 있었다. Northern 분석과 RT-PCR로 제초제 처리 시간에 따른 EPSPS의 발현량을 살펴본 결과, 제초제 처리 후 시간이 경과할수록 발현량이 증가하다가 7일 이후에는 감소하였고, wild type에 비해 glyphosate 내성 선발개체에서 전체적인 발현량이 높음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 선발된 glyphosate 내성 돌연변이체는 높은 EPSPS 효소활성 증가 및 EPSPS active site의 아미노산 시퀀스 변화를 통해 원할하고 지속적인 방향족 아미노산의 합성이 가능한 것으로 보여졌다. 본 실험을 통해 얻어진 glyphosate 내성 잔디 돌연변이체와 방법은 앞으로 유용한 제초제 저항성 돌연변이 품종개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국식품과학회지
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• 제35권3호
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• pp.366-372
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• 2003

유전자재조합 콩의 Agrobacterium sp. CP4 유래 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(CP4 EPSPS)를 편리하고 경제적으로 검출하고자 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 개발하였다. CP4 EPSPS에 대해 특이적인 다클론 및 단클론항체를 생산하였다. 다클론 항체의 경우 sandwich ELISA(검출한계, 0.03${\mu}g/mL$)는 competitive indirect ELISA(1${\mu}/mLg$)보다 CP4 EPSPS의 검출감도가 낮았다. 생산된 단클론항체 3종의 CP4 EPSPS에 대한 인식부위는 Mab1과 Mab2는 서로 같은 부위를 Mab3는 다른 부위를 인식하는 것으로 나타났다. 한편, 다클론항체 및 단클론항체를 조합하여 실시한 sandwich ELISA의 검출감도를 서로 비교하였다. 그 결과, 항원 포획단계에서 단클론항체 Mab2를 코팅하고 다클론항체-horseradish peroxidase(HRP) conjugate를 사용하였을 때 가장 양호한 검출감도(검출한계, 0.02${\mu}g/mL$)를 나타내었다. 본 연구에서 개발한 sandwich ELISA는 제초제 저항성 유전자재조합 콩의 분석에 적용가능할 것으로 생각된다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권2호
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• pp.97-103
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• 2005

Superoxide dismutase와 ascorbate peroxidase가 동시에 과대발현된 담배(CA)를 가지고 여러 제초제들에 대한 항산화 반응을 조사하였다. 온실조건 실험에서, CA 담배는 PSI 저해제로 알려진 paraquat처리에 대해서 내성이 인정되었고 그 정도는 40% 내외였다. PS II 저해제 (bromoxynil, diuron, bromacil), 엽록소 생합성 저해제 (oxyfluorfen), 카로티노이드 생합성 저해제 (fluridone)와 EPSP synthase 저해제 (glyphosate) 처리에서는 CA와 wild type간의 반응차이가 관찰되지 않았다. Paraquat와 diuron을 이용한 약광 조건의 실험에서도 온실조건의 실험결과와 유사한 정도로 paraquat처리에 대해서만 내성을 나타내었다. 온실조건에서의 엽위별 반응의 경우, 6 - 9 엽기 식물체에 paraquat를 처리하였을 때, 약제처리 당시 위로부터 3 - 4번째 전개되고 있었던 잎이 상대적으로 내성 정도가 높게 나타났다. 한편 paraquat 처리 시에 여러 농도의 ascorbic acid를 혼합할 경우, CA와 wild type 모두에서 비슷한 정도로 paraquat 활성을 경감시켰다. 결론적으로, CuZnSOD/APX의 과대발현은 photosystem I 에서 발생되는 산화스트레스에 대해서만 주로 작용하며, 다른 제초제들에 의해 발생되는 산화적 스트레스에 대해서는 소거 능력이 부족한 것으로 판단되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권4호
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• pp.375-380
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• 2007

국내 옥수수 순계주에서 Agrobacterium 공동배양으로 CP4 5-Enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) 유전자가 도입된 제초제저항성식물체를 개발하였다. 5개의 순계주 (HW1, KL103, HW3, HW4, HW7)의 미숙배를 Ubiquitin promoter-CP4 EPSPS 유전자와 CaMV35S promoter-nptII 유전자가 발현되도록 제조된 pCAMBIA2300 벡터를 C58C1 Agrobacterium에 형질전환하여 공동 배양하였다. 항생제로 paromomycin이 첨가된 배지에서 선발된 옥수수 형질전환체를 PCR, RT-PCR 및 Northern 분석을 통하여 유전자의 도입과 발현을 확인하였다. 또한 형질전환 식물체의 glyphosate 처리에 따른 shikimate 축적반응을 확인하였다. Paromomycin 저항성 캘러스 형성빈도는 옥수수 각 순계주 HW1, KL103, HW3, HW4, HW7에서 각각 0.37%, 0.03%, 2.20%, 2.37%, 0.81%로 나타났으며, PCR분석을 통하여 최종적으로 2개의 옥수수 순계주 (HW3, HW4)의 paromomycin 저항성 캘러스로부터 분화된 식물체에서 확인하였다. 이러한 형질전환체중에서 RT-PCR 및 Nothern blot 분석을 통하여 CP4 EPSPS 유전자가 발현되는 2개의 계통 (M266, M104) 을 선발하였고, shikimate 축적반응을 통하여 glyphosate에 대한 저항성을 갖는 계통 (M266)을 최종적으로 선발하였다. 이러한 결과는 국내 옥수수 순계주에서 제초제저항성을 갖는 옥수수 형질 전환체를 개발할 수 있음을 시사한다.