• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제11권3호
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• pp.273-276
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• 2006

RNA interference (RNAi), a process of sequence-specific gene suppression, has been known as a natural gene regulatory mechanism in a wide range of lower organisms. Recently, we have reported that a transfection of human U6 promoter (hU6) driven hairpin small-interference RNA (siRNA) plasmid specifically knocks down the target gene by post-transcriptional gene silencing in mammalian cells. Here we report that transfection of polymerase chain reaction (PCR) products, containing human U6 promoter with hairpin siRNA, knocks down the target gene expression in human teratocarcinoma NT-2/D1 cells. Moreover, we showed 3' end termination sequence, 5 Ts, is not critical elements for knocking down in PCR-based siRNA system. Therefore, the PCR-based siRNA system is a promising tool not only for the screening but also to temporally regulate gene expression in the human progenitor cells.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권4호
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• pp.241-247
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• 2005

선별마커로써 Lactococcus lactis ssp. lactis ATCC 7962 유래의 $\beta$-galactosidase 유전자를 포함하는 Lactococcus용 셔틀/발현 벡터 pWgall3T를 제조하여 Escherichia coli DH5$\alpha$와 고. Lactis MG1363내로 도입하였다. 이들 형질 전환체들은 X-gal을 포함하는 배지에서 파란색의 표현형을 보임으로써 쉽게 확인할 수 있었다. 또한, L. lactis MG1363 형질전환체로부터 $\beta$-galactosidase 활성을 측정한 결과 기존에 $\beta$-galactosidase를 활성을 지닌 L. lactis ATCC 7962에 비해 glucose를 포함하는 M17배지에서 4배정도 높은 활성을 보임으로써 선별마커로써의 효율성을 나타내었다. pWgal13T는 $\beta$-galactosidase 유전자 외에 L. lactis Wg2유래의 replicon과 외래 유전자의 발현을 위한 L. lactis ssp. cremoris LM0230의 promoter P13C, terminator를 포함하고 있다. 이 벡터의 이용가능성을 확인하기 위하여 외래 유전자 EGFP유전자를 P13C 아래에 삽입하여 E. coli와 L. iactis에서 발현을 확인하였다. 이 연구에서 제조된 Lactococcus용 발현 벡터 pWgal13T는 E. coli와 L. lactis에서 외래 유용 유전자를 생산을 위해 이용 할 수 있을 것이다.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제34권1호
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• pp.11-15
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• 2017

We constructed the fibroin H-chain expression system to produce enhanced cyan fluorescent proteins (ECFP) in transgenic silkworm cocoon. Fluorescent cocoon could be made by fusing ECFP cDNA to the heavy chain gene and injecting it into a silkworm. The ECFP fusion protein, each with N- and C-terminal sequences of the fibroin H-chain, was designed to be secreted into the lumen of the posterior silk glands. The expression of the ECFP/H-chain fusion gene was regulated by the fibroin H-chain promoter. The use of the 3xP3-driven EGFP cDNA as a marker allowed us to rapidly distinguish transgenic silkworms. The EGFP fluorescence became visible in the ocelli and in the central and peripheral nervous system on the seventh day of embryonic development. A mixture of the donor and helper vector was micro-injected into 1,020 Kumokjam, bivoltin silkworm eggs. We obtained 6 broods. The cocoon was displayed strong blue fluorescence, proving that the fusion protein was present in the cocoon. Accordingly, we suggest that the ECFP fluorescence silk will enable the production of novel biomaterial based on the transgenic silk.

• 한국정보통신학회:학술대회논문집
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• 한국정보통신학회 2016년도 춘계학술대회
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• pp.711-714
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• 2016

재조합 베큘로바이러스는 cytomegalovirus (CMV) promoter, polyhedron promoter, vesicular stomatitis virus G (VSVG), enhanced green fluorescent protein (EGFP), protein transduction domain (PTD) 유전자로 구성된다. 본 재조합 베큘로바이러스 벡터는 세포주와 조직에 감염시켰고 그 결과 다른 벡터 시스템에 비교하여 재조합된 유전자의 전이와 유전자 발현에 있어서 새로운 가능성이 발견되었다. 본 재조합 베큘로바이러스 시스템의 유전자의 전이와 발현의 효율은 타 벡터시스템 보다 우수하였다.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제31권2호
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• pp.85-89
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• 2015

This peptide has antibacterial activity against several Gram-positive and Gram-negative bacteria. Bombyx mori cecropinB1(BmCecB1) is antimicrobial peptides from Bombyx mori and belongs to cecropin family. Antimicrobial peptides are important components of the innate immune systems in all living organism. To produce the BmCecB1 antimicrobial peptide, we constructed transgenic silkworm that expressed BmCecB1 gene under the control BmA3 promoter using piggyBac vector. The use of the 3xP3-driven EGFP cDNA as a marker allowed us to rapidly distinguish transgenic silkworm. Mixtures of the donor vector and helper vector were micro-injected into 600 eggs of bivoltin silkworms, Baegokjam. In total, 49 larvae (G0) were hatched and allowed to develop into moths. The resulting G1 generation consisted of 22 broods, and we selected 2 broods containing at least 1 EGFP-positive embryo. The rate of successful transgenesis for the G1 broods was 9%. We identified 9 EGFP-positive G1 moths and these were backcrossed with wild-type moths. With the aim of identifying a BmCecB1 as antimicrobial peptide, we investigated the Radical diffusion Assay (RDA) and then demonstrated that BmCecB1 possesses high antibacterial activities against Gram-negative bacteria.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제27권11호
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• pp.1644-1651
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• 2014

Transgenic animals have become important tools for the production of therapeutic proteins in the domestic animal. Production efficiencies of transgenic animals by conventional methods as microinjection and retrovirus vector methods are low, and the foreign gene expression levels are also low because of their random integration in the host genome. In this study, we investigated the homologous recombination on the porcine ${\beta}$-casein gene locus using a knock-in vector for the ${\beta}$-casein gene locus. We developed the knock-in vector on the porcine ${\beta}$-casein gene locus and isolated knock-in fibroblast for nuclear transfer. The knock-in vector consisted of the neomycin resistance gene (neo) as a positive selectable marker gene, diphtheria toxin-A gene as negative selection marker, and 5' arm and 3' arm from the porcine ${\beta}$-casein gene. The secretion of enhanced green fluorescent protein (EGFP) was more easily detected in the cell culture media than it was by western blot analysis of cell extract of the HC11 mouse mammary epithelial cells transfected with EGFP knock-in vector. These results indicated that a knock-in system using ${\beta}$-casein gene induced high expression of transgene by the gene regulatory sequence of endogenous ${\beta}$-casein gene. These fibroblasts may be used to produce transgenic pigs for the production of therapeutic proteins via the mammary glands.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권1호
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• pp.9-14
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• 2008

조혈 줄기 세포에의 효과적인 유전자 전달은 유전자 치료의 새로운 가능성을 제시할 수 있다. 레트로바이러스를 이용한 유전자 전달 기술은 많은 기초 연구와 임상 시도가 이루어진 대표적인 바이러스이다. 그러나 현재 사용되고 있는 in vitro에서의 조혈 줄기 세포에의 유전자 도입은 조혈 줄기 세포의 분화 유도, 자기 복제 능력과homing 능력의 저하 등 많은 문제점이 있다. 본 연구는 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로서 마우스의 대퇴골에 직접 레트로바이러스를 이식하는 IBM (Intra-Bone Marrow) 방법을 이용하여 조혈 줄기 세포에의 효과적인 유전자 도입을 시도하였다. IBM 이식 2주 후 마우스의 각 조직을 분석한 결과, 골수뿐 아니라 림파절, 비장, 간장 세포 등에서 유전자가 안정적으로 발현하는 것을 관찰하였다. 또한, $6.4{\pm}2.7%$의 골수조직 존재 조혈줄기/전구세포에서 도입된 유전자가 안정적으로 발현하고 있는 사실을 확인하였다. 본 연구의 결과를 바탕으로 IBM 이식 방법을 이용한 생체 조직 내 레트로바이러스의 유전자 도입은 조혈 줄기 세포를 이용한 유전자 치료에 매우 효과적인 방법이라는 사실을 시사해주고 있다.

• 생명과학회지
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• 제21권12호
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• pp.1726-1731
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• 2011

본 연구의 목적은 누에형질전환체를 이용하여 재조합단백질 대량생산 시스템을 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 hSCF유전자를 이용하여 누에에서 재조합단백질을 생산하였다. 실험에 사용된 piggyBac 전이벡터는 hSCF 유전자의 발현 조절을 위해 초파리 유래의 dHsp70 promoter를 사용하였고, EGFP marker유전자는 3xP3 promoter로 발현을 조절하였다. 총 1,020 개의 누에알에 microinjection 하여 G1 세대에서 22 bloods의 형질전환체를 선발하였고, 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 GFP 형광을 관찰 할 수 있었다. hSCF 재조합단백질의 발현은 Western blot 분석으로 확인 할 수 있었고, inverse PCR 분석을 통해서 누에 게놈에 전이벡터가 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 지금까지의 실험 결과에서 hSCF 재조합 단백질이 누에에서 생산될 수 있음을 확인 할 수 있었다. 비록 누에에서 생산된 hSCF 재조합단백질의 생리활성에 대한 실험이 추후에 요구되지만, 이러한 실험결과는 piggyBac 전이벡터와 microinjection 법으로 누에에서 고부가가치의 재조합단백질을 대량생산 할 수 있음을 보여 주었다고 할 수 있겠다. 따라서 누에를 유용물질 생산을 위한 생체반응기로서 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제50권2호
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• pp.87-92
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• 2012

본 연구의 목적은 누에형질전환 기술을 이용하여 적색형광실크를 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 피브로인 H-chain의 N-말단과 C-말단을 이용하여 피브로인 재조합 단백질 발현 시스템을 제작하였고, 종결 코돈이 없는 DsRed2 유전자를 위의 발현 시스템에 클로닝하여 적색형광실크를 제작하였다. 누에형질전환체 선발을 위해서는 3xP3 promoter와 EGFP 유전자를 이용하여 선발하였고, 1020개의 누에알에 microinjection 하여 F1 세대에서 6 broods의 형질전환체를 선발하였다. 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 EGFP 형광단백질이 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 실크의 피브로인에서 DsRed2 단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해, F2세대의 누에형질전환체 중에서 5령 5일 유충을 해부하여 견사선을 형광현미경으로 관찰하였고, 중부와 후부 견사선에서 적색형광단백질이 발현되는 것을 확인 할 수 있었고, F2 세대의 고치에서도 적색형광단백질의 발현을 확인할 수 있었다. 이상의 결과에서 적색형광실크를 생산하는 누에형질전환체가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있었고 이러한 결과를 토대로 새로운 산업소재로서 실크를 활용할 수 있을 것으로 기대한다.

• 생명과학회지
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• 제34권7호
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• pp.493-499
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• 2024

항균 펩타이드는 동물과 식물이 가지고 있는 고유의 항균 물질로 적은 양으로도 강한 항균활성을 나타내며 이외에도 항바이러스, 항산화 등 다양한 기능을 가지고 있다. 식물은 물과 햇빛으로 키울 수 있어 적은 비용으로 대량 생산이 가능하다. 식물의 엽록체를 형질전환 시켜 항균 펩타이드를 생산하면 단백질 발현량이 증가하고 꽃가루에 의한 유전자 이동이 일어나지 않기 때문에 생태계가 오염될 가능성이 적다. 그러나 형질전환 된 엽록체를 이용하여 재조합 단백질을 생산하면 단백질이 분해되고 용해도가 감소한다. 이를 해결하기 위해 융합 단백질 종류 중 하나인 SUMO를 발현시킬 재조합 단백질과 융합하여 제작하였다. 항균 펩타이드 stomoxyn은 침파리(stable fly)에 있는 항균물질이다. Stomoxyn은 α-helix 구조이고 양친매성이어서 박테리아 세포막에 부착된 후 세포막을 용해시킨다. 본 연구에서는 stomoxyn을 식물 엽록체와 대장균에서 발현시키기 위한 형질전환 벡터를 제작하였고, 이 벡터를 이용하여 대장균에서 stomoxyn의 발현을 확인하였다. 대장균에서 발현된 stomoxyn을 nickel column과 SUMOase를 처리하여 정제한 후 agar diffusion assay를 이용하여 항균 활성을 확인하였다. 또한 식물 엽록체에서 벡터의 삽입을 확인하기 위해 EGFP 유전자를 사용하여 확인하였다.