• Reproductive and Developmental Biology
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• 제38권2호
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• pp.71-77
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• 2014

The specific genetic modification in porcine somatic cells by gene targeting has been very difficult because of low efficiency of homologous recombination. To improve gene targeting, we designed three kinds of knock-out vectors with ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase gene (${\alpha}1,3$-GT gene), DT-A/pGT5'/neo/pGT3', DT-A/NLS/pGT5'/neo/pGT3' and pGT5'/neo/ pGT3'/NLS. The knock-out vectors consisted of a 4.8-kb fragment as the 5' recombination arm (pGT5') and a 1.9-kb fragment as the 3' recombination arm (pGT3'). We used the neomycin resistance gene (neo) as a positive selectable marker and the diphtheria toxin A (DT-A) gene as a negative selectable marker. These vectors have a neo gene insertion in exon 9 for inactivation of ${\alpha}1,3$-GT locus. DT-A/pGT5'/neo/pGT3' vector contain only positive-negative selection marker with conventional targeting vector. DT-A/NLS/pGT5'/neo/pGT3' vector contain positive-negative selection marker and NLS sequences in upstream of 5' recombination arm which enhances nuclear transport of foreign DNA into bovine somatic cells. pGT5'/neo/pGT3'/NLS vector contain only positive selection marker and NLS sequence in downstream of 3' recombination arm, not contain negative selectable marker. For transfection, linearzed vectors were introduced into porcine ear fibroblasts by electroporation. After 48 hours, the transfected cells were selected with $300{\mu}g/ml$ G418 during 12 day. The G418-resistant colonies were picked, of which 5 colonies were positive for ${\alpha}1,3$-GT gene disruption in 3' PCR and southern blot screening. Three knock-out somatic cells were obtained from DT-A/NLS/ pGT5'/neo/pGT3' knock-out vector. Thus, these data indicate that gene targeting vector using nuclear localization signal and negative selection marker improve targeting efficiency in porcine somatic cells.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권3호
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• pp.205-209
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• 2008

본 연구는 돼지 $\beta$-casein 유전자 위치에서 EGFP가 발현될 수 있는 knock-in 벡터를 구축하기 위하여 실시되었다. 돼지의 $\beta$-casein 유전자를 이용하여 knock-in 벡터를 구축하기 위해 돼지의 태아 섬유아세포로부터 $\beta$-casein 유전자를 동정하였고 EGFP, SV4O polyA signal을 동정하였다. Knock-in 벡터는 5' 상동 영역 약 5 kb와 3' 상동 영역 약 2.7 kb로 구성되어있으며, positive selection marker로 $neo^{r}$ 유전자를, negative selection marker로 DT-A 유전자를 사용하였다. 구축된 knock-in 벡터로부터 EGFP의 발현을 확인하기 위하여 생쥐 유선 세포인 HC11 세포에 knock-in 벡터를 도입하였다. 그 결과 EGFP의 발현을 HC11 세포에서 확인하였다. 이와 같은 결과로서 이 block-in 벡터는 knock-in 형질전환 돼지를 생산하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제25권3호
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• pp.263-268
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• 2015

체강 소체는 꼬마 선충에서 내화과정을 통해 체강 내 액체를 세포 안으로 들여오는 특이적인 세포이다. 본 연구실에서의 최근 연구 결과에 의하면, 꼬마 선충에서 식이제한에 의한 수명연장에 체강 소체가 필수적임이 발견되었다. 본 연구에서는 꼬마 선충에서 체강 소체를 제거하였을 경우, 환경적 스트레스에 대한 저항성과 번식력을 개체 수준에서 연구하였다. 체강 소체는 체강 소체에만 특이적으로 발현하는 디프테리아 독소를 이용하여 제거하였다. 먼저 자외선에 대한 저항성은 20 J/cm²/min의 자외선을 조사한 후, 생존률의 변화를 매일 기록하였다. 또한 꼬마 선충을 35℃ 배양기에 10시간 동안 배양하여 열 스트레스를 가한 후, 생존률의 변화를 관찰하였다. 산화성 스트레스는 paraquat를 이용하여 생체 내 산화성 스트레스를 유도한 다음, 산화성 스트레스에 대한 저항성을 비교하다. 번식력의 경우, 번식기간 동안의 총 자손의 수와 날짜 별 자손의 수를 비교 분석하였다. 그 결과, 체강소체는 개체의 자외선 스트레스의 저항성에는 필수적이지만, 열과 산화성 스트레스 저항성에는 영향을 미치진 않는 것으로 보인다. 그리고 개체의 번식력에도 관여하는 것으로 나타났다. 본 연구 결과는 노화 및 식이제한에 의한 수명연장의 기전을 이해하는데 기여할 것으로 사료된다.