• 제목/요약/키워드: DNA probe method

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올리고뉴클레오타이드 제작을 위해 효율적이고 차별적인 시드를 고르는 방법에 대한 고찰 (A Study of Choosing Efficient Discriminative Seeds for Oligonucleotide Design)

  • 정원형;박성배
    • 한국정보과학회논문지:시스템및이론
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    • 제36권1호
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    • pp.1-8
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    • 2009
  • 생물정보분야에서 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 제작하는 문제는 시간을 많이 소모하는 문제이다. 이 문제를 해결하기 위하여 해시를 이용한 가속계산이 주로 쓰이고 있고 BLAST란 프로그램이 대표적으로 생물정보분야에서 사용되고 있다. BLAST류의 프로그램들은 DNA서열의 특성에 따라 시드를 변형하여 해시를 개선하는 알고리즘을 적응하여 서열간의 유사도가 높은 부분을 찾는다. 그러나 이 프로그램들은 원래 올리고뉴클레오타이드 제작을 위해서가 아닌 지역정렬 문제를 해결하기 위한 방법들로써 발전하여 왔으므로 본 문제에 효율적인가에 대한 검증이 아직까지 이루어지지 않았다. 우리는 BLAST류의 프로그램에서 사용된 시드(seed)들이 올리고뉴클레오타이드 제작에 효과적인가를 판단할 수 있는 효율적이고 차별적인 잣대를 제시하고 이에 따라 다섯 종류의 대표적인 시드를 평가하였다. 평가에서 spaced seed라는 시드가 가장 좋은 결과를 보임을 정량적으로 계산할 수 있었다.

Rapid Detection and Monitoring Therapeutic Efficacy of Mycobacterium tuberculosis Complex Using a Novel Real-Time Assay

  • Jiang, Li Juan;Wu, Wen Juan;Wu, Hai;Ryang, Son Sik;Zhou, Jian;Wu, Wei;Li, Tao;Guo, Jian;Wang, Hong Hai;Lu, Shui Hua;Li, Yao
    • Journal of Microbiology and Biotechnology
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    • 제22권9호
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    • pp.1301-1306
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    • 2012
  • We combined real-time RT-PCR and real-time PCR (R/P) assays using a hydrolysis probe to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)-specific 16S rRNA and its rRNA gene (rDNA). The assay was applied to 28 non-respiratory and 207 respiratory specimens from 218 patients. Total nucleic acids (including RNA and DNA) were extracted from samples, and results were considered positive if the repeat RT-PCR threshold cycle was ${\leq}35$ and the ratio of real-time RT-PCR and real-time PCR load was ${\geq}1.51$. The results were compared with those from existing methods, including smear, culture, and real-time PCR. Following resolution of the discrepant results between R/P assay and culture, the overall sensitivity, specificity, positive predictive values (PPV), and negative predictive values (NPV) of all samples (including non-respiratory and respiratory specimens) were 98.2%, 97.2%, 91.7%, and 99.4%, respectively, for R/P assay, and 83.9%, 89.9%, 72.3%, and 94.7%, respectively, for real-time PCR. Furthermore, the R/P assay of four patient samples showed a higher ratio before treatment than after several days of treatment. We conclude that the R/P assay is a rapid and accurate method for direct detection of MTBC, which can distinguish viable and nonviable MTBC, and thus may guide patient therapy and public health decisions.

Bacillus stearothermophilus Peptidyl Prolyl cis-trans Isomerase의 정제 및 유전자 분석 (Purification and Gene Analysis of Peptidyl Prolyl cia-trans Isomerase from Bacillus stearothermophilus)

  • 김동주
    • 한국식품영양학회지
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    • 제15권2호
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    • pp.104-111
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    • 2002
  • 호열균 B. stearotheymophilus으로부터 단백질 고차구조 형성을 촉진하는 내열성 PPIase를 정제하기 위해, 이 균체를 대량으로 배양 집균, 파쇄하여 효소활성을 측정하였다. 효소의 활성측정은 N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pAN)를 기질로 사용하였다. chymotrypsin은 기질 이성체(cis-trans 형)의 한쪽(trans)만을 특이적으로 분해하는 반응을 이용하여 PPIase 활성을 측정하였다. 호열균 추출시료로 부터 효소활성을 확인한 후, DEAE-sepharose CL-6B, Sephadex G-75로 정제 후, 최종적으로 Superose TM-12 (FPLC) gel-필트레이션으로 분자량 18kDa의 본 효소를 정제하였다. 정제한 효소의 화학적 특징을 조사한 결과 pH 7.5~8.0사이에 안정하였으며, 최적 pH는 8.0으로 나타났다. 그리고 $65^{\circ}C$에 30분간 열처리 후, 효소활성을 측정한 결과 50%이상의 잔존 활성을 갖는 내열성 효소임을 확인하였다. 정제 단백질의 N-말단 아미노산 분석은 Edman 분해법으로 39 아미노산 잔기를 결정하였다. 그리고 PPIase의 재구성(refolding) 반응은, 요소로 변성시킨 기질 RNase 1을 이용하여 이 단백질의 재구성 (refolding) 실험을 조사한 결과, PPIase는 변성 기질 RNase 1의 재구성(refolding)을 촉진하는데 높은 효과를 가지고 있었다. 호열균 유전자 라이브러리로부터 PPIase 유전자 약 3kb을 클로닝하였다. 재조합 플라스미드 cPI-40에서 프라이머(A-1, B-2)를 이용하여 PPIase N-말단을 코드하는 유전자를 PCR법으로 증폭하여, 염기배열을 결정한 결과 증폭된 단편은 165염기로 형성된 55 아미노산 잔기를 코드하는 open reading frame(ORF)가 연속되고 있었다. 그리고 Edman법으로 결정한 PPIase의 39아미노산 잔기가 이 배열내에 완전히 보존되어 있었다. 이 결과로부터 이 ORF는PPIase구조 유전자의 1/3에 해당하는 단편임을 확인하였다.

Bacillus stearothermophilus의 Peptidyl Prolyl cis-trans Isomerase 유전자 분리 염기배열 및 발현 (Gene Cloning, Nucleotide Sequence and Efficent Expression of Peptidyl proryl cis-trans Isomerase from Bacillus stearothermophilus)

  • 김동주
    • 한국식품영양학회지
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    • 제9권4호
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    • pp.452-458
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    • 1996
  • 호열균 B. stearothermophilus의 세포내 PPIase를 정제하여 Edman 법으로 N-말단 아미노산 배열을 결정하여 이를 바탕으로 합성한 올리고누클레오티드의 프리머를 이용하여, 서턴 분석하여 PPIase 유전자 약 3.0kb를 클로닝하였다.(pPI-40) PPI-40으로부터 PPIase N-말단 배열을 코드 하는 영역으로부터 합성한 프리머(A-1, B-2)를 이용하여, PCR법으로 PPIase N-말단을 코드 하는 유전자를 증폭하여, 염기배열을 경정한 후, 그 정보에 따라 유전 해석한 결과 PCR로 증폭된 단편(pSN-18)은 165염기로부터 형성된 55 아미노산잔기를 코드 하는 open reading frame (ORF)이 계속되고 있었고, Edman법으로 결정한 PPIase N-말단 아미노산 39 아미노산잔기가 완전히 일치하였다. 그리고, 이 ORF를 중심으로, 지금까지 클론화된 대장균의 PPIasea (cytoplasm)와 PPIase b(periplasm)의 아미노산 일차구조 해석으로부터 각각 58%(cytoplasm), 16%(periplasm)의 상동성을 나타냈다. PPIase 구조 유전자를 갖는 재조합플라스미드 pPI-40을 JM109로 형질전환하여 Lac 프로모터로 PPIase 단백질을 발현시켰다. 효소 분자량을 SDSPAGE로 확인한 결과 약 18kDa으로 호열균 B. stearothermophilus로부터 정제한 단백질 분자량과 동일하다. 면역억제(CsA, FK506)와의 화학적인 반응은 대장균의 PPIase와 동일하게, 면역억제와는 비감수성으로 나타났다.

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Detection of Campylobacter jejuni in food and poultry visors using immunomagnetic separation and microtitre hybridization

  • Simard, Ronald-E.
    • 한국어업기술학회:학술대회논문집
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    • 한국어업기술학회 2000년도 춘계수산관련학회 공동학술대회발표요지집
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    • pp.71-73
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    • 2000
  • Campylobacter jejuni is most frequently identified cause of cause of acute diarrhoeal infections in developeed countries, exceeding rates of illness caused by both salmonella and shigilla(Skirrow, 1990 ; Lior 1994). Previous studies on campylobacter jejuni contamination of commercial broiler carcasses in u.s.(Stern, 1992). Most cases of the disease result from indirect transmission of Campylobactor from animals via milk, water and meat. In addition to Campylobactor jejuni. the closely relates species Campylobactor coli and Campylobactor lari have also been implicated as agents of gastroenteritis in humans. Campylobactor coli represented only approximately 3% of the Campylobactor isolates from patients with Campylobactor enteritis(Griffiths and Park, 1990) whereas Campylobactor coli is mainly isolated from pork(Lmmerding et al., 1988). Campylobactor jejuni has also been isolated from cases of bacteremia, appendicitis and, recently, has been associated with Guillai-Barre syndrome(Allos and Blaser, 1994; von Wulffen et al., 1994; Phillips, 1995). Studies in volunteers indicated that the infectious dose for Campylobactor jejuni is low(about 500 organisms)(Robinson, 1981). The methods traditionally used to detect Campylobactor ssp. in food require at least two days of incubation in an enrichment broth followed by plating and two days of incubation on complex culture media containing many antibiotics(Goossens and Butzler, 1992). Finnaly, several biochemical tests must be done to confirm the indentification at the species level. Therfore, sensitive and specific methods for the detection of small numbers of Campylobactor cells in food are needed. Polymerase chain reaction(PCR) assays targeting specific DNA sequences have been developed for the detection of Campylobactor(Giesendorf and Quint, 1995; Hemandex et al., 1995; Winter and Slavidk, 1995). In most cases, a short enrichment step is needed to enhance the sensitivity of the assay prior to detection by PCR as the number of bacteria in the food products is low in comparison with those found in dinical samples, and because the complex composition of food matrices can hinder the PCR and lower its sensitivity. However, these PCR systems are technically demanding to carry out and cumbersome when processing a large number of samples simutaneously. In this paper, an immunomagnetic method to concentrate Campylobactor cells present in food or clinical samples after an enrichment step is described. To detect specifically the thermophilic Campylobactor. a monoclonal antibody was adsorbed on the surface of the magnetic beads which react against a major porin of 45kDa present on the surface of the cells(Huyer et al., 1986). After this partial purification and concentration step, detection of bound cells was achieved using a simple, inexpensive microtitre plate-based hybridization system. We examined two alternative detection systems, one specific for thermophilic Campylobactor based on the detection of 23S rRNA using an immobilized DNA probe. The second system is less specific but more sensitive because of the high copy number of the rRNA present in bacterial cell($10^3-10^4$). By using specific immunomagnetic beads against thermophilic Campylobactor, it was possible to concentrate these cells from a heterogeneous media and obtain highly specific hybridization reactions with good sensitivity. There are several advantages in using microtitre plates instead of filter membranes or other matrices for hybridization techniques. Microtitre plates are much easier to handle than filter membranes during the adsorption, washing, hybridization and detection steps, and their use faciilitates the simultanuous analysis of multiple sample. Here we report on the use of a very simple detection procedure based on a monoclonal anti-RNA-DNA hybrid antibody(Fliss et al., 1999) for detection of the RNA-DNA hybrids formed in the wells.

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Detection of HER2 Status in Breast Cancer: Comparison of Current Methods with MLPA and Real-time RT-PCR

  • Pazhoomand, Reza;Keyhan, Elahe;Banan, Mehdi;Najmabad, Hossein;Karimlou, Masoud;Khodadad, Faranak;Iraniparast, Alireza;Feiz, Farnaz;Majidzadeh, Keivan;Bahman, Ideh;Moghadam, Fatemeh Aghakhani;Sobhani, Atoosa Madadkar;Abedin, Seyedeh Sedigheh;Muhammadnejad, Ahad;Behjat, Farkhondeh
    • Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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    • 제14권12호
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    • pp.7621-7628
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    • 2013
  • Human epidermal growth factor receptor (HER) status is an important prognostic factor in breast cancer. There is no globally accepted method for determining its status, and which method is most precise is still a matter of debate. We here analyzed HER2 mRNA expression by quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) and HER2 DNA amplification using multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA). In parallel, we performed a routine evaluation of HER2 protein by immunohistochemistry (IHC). To assess the accuracy of the RT-PCR and MLPA techniques, a combination of IHC and fluorescence in situ hybridization (FISH) was used, substituting FISH when the results of IHC were ambiguous (2+) and for those IHC results that disagreed with MLPA and qRT-PCR, this approach being termed IHC-FISH. The IHC results for four samples were not compatible with the MLPA and qRT-PCR results; the MLPA and qRT-PCR results for these samples were confirmed by FISH. The correlations between IHC-FISH and qRT-PCR or MLPA were 0.945 and 0.973, respectively. The ASCO/CAP guideline IHC/FISH correlation with MLPA was (0.827) and with RT-PCR was (0.854). The correlations between the IHC results (0, 1+ as negative, and 3+ as positive) and qRT-PCR and MLPA techniques were 0.743 and 0.831, respectively. Given the shortcomings of IHC analysis and greater correlations between MLPA, qRT-PCR, and FISH methods than IHC analysis alone with each of these three methods, we propose that MLPA and real-time PCR are good alternatives to IHC. However a suitable cut-off point for qRTPCR is a prerequisite for determining the exact status of HER2.

HL6O 세포주의 분화 시 감소 특성을 보이는 Glutathione S-Transferase의 클로닝 (Cloning of a Glutathione S-Transferase Decreasing During Differentiation of HL60 Cell Line)

  • 김재철;박인규;이규보;손상균;김문규;김정철
    • Radiation Oncology Journal
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    • 제17권2호
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    • pp.151-157
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    • 1999
  • 목적 : HL60 세포주에서 PMA(phorbol 12-myrisate 13-acetate) 및 DMSO(dlmethyisulfoxlde) 에 의해 분화가 유도될 때 감소되는 특성을 보이는 K872 클론에 대한 염기 서열, 조직 분포, 단백 분리 등을 시행하였다. 재료 및 방법 QIA plasmid extraction kit(Qiagen GmbH, Germany)를 이용하여 사람의 모유두 세포 pBluescript phagemid cDNA library로부터 K872 클론을 추출하였다. Sanger's dideoxy nucleotide chain-termination method을 이용하여, 추출한 K872 클론의 염기 서열을 분석하였다. BLAST(Basic Local Alignment Search Tools) 프로그램으로 유전자은행의 염기 서열과의 상동성을 검색하였다. K872 클론으로 만든 probe로 다양한 인간 조직 및 암세포주로부터 분리한 RNA에 대하여 nothern blot을 시행하였다. His-Patch Thifusion expression system을 이용하여 대장균 배지에 0.1mM IPTG(Isopropyl-$\beta$-thlogalactopyranoslde) 를 첨가해서 결합단백의 유전자 발현을 유도하였다. 결합단백이 함유된 용출액을 SDS-PAGE에 걸어서 발현된 단백을 확인하였다. 결과 : K872 클론은 675개의 코딩 영역과 280개의 코딩과 관련없는 영역으로 구성된 1006개의 염기로 구성됨을 관찰하였다. 해독틀로 추정되는 부분은 시작 코돈을 포함하여 길6개의 아미노산을 형성하고 단백 산물의 분자량은 25,560 Da으로 추정되었다. 추정 아미노산 배열은 쥐의 glutathlone S-transferase kappa 1(rGSTKl) 의 아미노산 배열과 70$\%$의 상동성을 보였다. nothern blot에 따른 발현 양상은 심장, 수의근, 말초혈액 백혈구 등의 조직에서 높은 발현을 보였으며 방사선 내성과 관련지어 볼 때 대장암 및 흑색종 세포주에서 발현이 높았던 점은 특기할 만하였다. 결론 : 상동성 검색 결과 K872 유전자는 항암제 및 방사선 내성과 관련이 있는 rGSTK1에 대한 사람의 상동유전자로 사료되며 향후 이와 관련한 기능 분석이 필요할 것으로 사료된다

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다중구슬 폐구균 혈청형 분석법의 국내 확립과 적용 연구 (Establishment and Application of a Multibead Serotyping Assay for Pneumococci in Korea)

  • 김한울;이소영;이미애;김경효
    • Pediatric Infection and Vaccine
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    • 제22권2호
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    • pp.97-105
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    • 2015
  • 목적: 폐구균의 혈청형 분석은 백신의 효능을 평가하고 감시하는데 매우 중요하다. 그러나 폐구균의 혈청형 분석이 힘들기 때문에 최근 라텍스 구슬과 흐름세포측정기를 이용한 다중구슬 혈청형 분석법이 소개되었다. 이 연구에서는 새로운 혈청형 분석법을 이화백신연구센터에서 구축하고 실제 임상 검체들에 적용해보았다. 방법: 라텍스 구슬 3종과 폐구균 피막다당 특이 단클론항체 1가지, 시동체 2종을 Univerisity of Alabama at Birmingham에서 제공 받았다. 이 시료들을 이용하여 단클론항체와 wzy 다중 PCR을 이용한 다중구슬 혈청형 분석법을 확립하였다. 그리고 75개의 혈청형이 알려져 있는 검체를 이용하여 이화백신효능연구센터에 확립된 다중구슬 혈청형 분석법의 정확도를 보았고 이를 토대로 528개의 임상 검체를 분석해 보았다. 결과: 다중구슬 혈청형 분석법은 이화백신효능연구센터에 안정적으로 확립되었다. 75종의 이미 혈청형이 알려져 있는 검체를 암호화하여 분석한 결과 전부 일치하여 정확도가 높음을 보여 주었고 실제 임상 검체에도 적용한 결과 94.3% (498/528)에서 혈청형을 확인할 수 있었다. 결론: 다중구슬 분석법은 다수의 혈청형을 쉽고 빠르게 한번에 많은 수의 검체를 확인할 수 있는 객관적인 검사 방법으로 향후 임상적 진단과 역학연구 등의 폐구균의 혈청형 분석에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

사람 폐암 세포주에서 포도당 운반 단백 유전자의 발현 (Glucose Transporter Gene Expression in Human Lung Cancer Cell Lines)

  • 김우진;임재준;이재호;유철규;정희순;한성구;정준기;심영수;김영환
    • Tuberculosis and Respiratory Diseases
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    • 제45권4호
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    • pp.760-765
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    • 1998
  • 연구배경: 암세포에서 포도당의 유입이 증가되어 있다는 사실이 오래 전부터 알려져 왔고 이런 현상을 이용하여 FDG-PET 영상이 암의 진단에 이용되고 있다. 그러나, 암세포에서 포도당 유입이 증가하는 기전에 대해서는 모르고 있다. 최근, 여러 연구에서 소화기계의 악성종양과 두경부종양에서 포도당 운반체의 mRNA 의 존재가 증명되었고, 포도당 운반체가 암세포에서의 포도당 유입 증가와 관련이 있을 가능성을 시사하였다. 폐암에서도 포도당대사가 항진되어 있다. 저자등은 폐암에서의 포도당 유입이 증가하는 기전에 대해 알아 보기 위하여 사람 폐암세포주에서 포도당 mRNA의 발현여부를 확인하였다. 방 법: 15종의 사람 폐암 세포주와 불멸화시킨 기관지 상피세포주에서 total RNA를 추출하였다. $20{\mu}g$의 total RNA를 전기영동시킨후, 포도당 운반체 1형과 3 형에 대한 cDNA를 probe로 Northern blot analysis를 시행하였다. 결 과: 14종의 사람 폐암 세포주중에서 13종에서 포도당 운반체 1형의 mRNA 발현을 확인하였고, 14종의 사람 폐암 세포주중에서 10종에서 포도당 운반체 3형의 mRNA 발현을 확인하였다. 불멸화시킨 기관지 상피세포주의 포도당 운반체 1형의 mRNA 발현을 확인할 수 있었고 3형의 mRNA 발현은 확인할 수 없었다. 결 론: 폐암에서 포도당 대사의 증가는 포도당 운반체 1형과 3형의 발현과 관련이 있을 것으로 사료된다.

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Southern Analysis after Long-range PCR: Clinical Application in Korean Patients with Myotonic Dystrophy 1

  • Yum, Mi-Sun;Lee, Beom Hee;Kim, Gu-Hwan;Lee, Jin-Joo;Choi, Seung Hoon;Lee, Joo Yeon;Kim, Jae-Min;Kim, Yoo-Mi;Ko, Tae-Sung;Yoo, Han-Wook
    • Journal of Genetic Medicine
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    • 제10권1호
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    • pp.33-37
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    • 2013
  • Purpose: Myotonic dystrophy 1 (DM1, OMIM 160900) is an autosomal-dominant muscular disorder caused by an expansion of CTG repeats in the 3' UTR of the DMPK gene. Variable expansions of CTG repeats preclude the accurate determination of repeat size. We tried to show the clinical and analytical validity of the application of Southern blotting after long-range PCR was demonstrated in Korean DM1 patients. Materials and Methods: The Southern blotting of long-range PCR was applied to 1,231 cases with clinical suspicion of DM1, between 2000 and 2011. PCR was performed using genomic DNA with forward 5'-CAGTTCACAACCGCTCCGAGC-3' and reverse 5'-CGTGGAGGATGGAACACGGAC-3' primers. Subsequently, the PCR fragments were subjected to gel electrophoresis, capillary transfer to a nylon membrane, hybridization with a labeled (CAG)10 probe. The correlation between clinical manifestations and the CTG repeat expansions were analyzed. Results: Among a total of 1,231 tested cases, 642 individuals were diagnosed with DM1 and the range of the detected expansion was 50 to 2,500 repeats; fourteen cases with mild DM1 ($75{\pm}14$ repeats), 602 cases with classical DM1 ($314{\pm}143$ repeats), and 26 cases with congenital DM1 ($1,219{\pm}402$ repeats). The positive and negative predictive values were 100%. The age at test requested and the CTG repeat numbers were inversely correlated (R=-0.444, P<0.01). Conclusion: This study indicates that Southern blotting after long-range PCR is a reliable diagnostic method DM1.