• The Plant Pathology Journal
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• 제15권5호
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• pp.295-301
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• 1999

Many of plant defense responses are consequence of transcriptional activation of related genes. We have developed a modified differential screening procedure to isolate tobacco genes that are involved in the defense responses against TMV infection. A cDNA library was constructed from Nicotiana glutinosa leaves infected by TMV under temperature shift conditions. Each of plasmid DNA in the library was hybridized on a set of slot blots to a pool of cDNA probes prepared from either TMV-infected or mock-treated tobacco leaves. Among 900 plasmid DNAs, 81 clones exhibiting significantly enhanced or reduced level of hybridization to either probe were selected for nucleotide sequencing. The clones were listed into 61 genes considering redundancy between the sequences. The genes were identified to be defense-related genes including PR-genes and genes involved in primary or secondary metabolisms. This results supports the implication that plant defense process entails a major shift in total cellular metabolisms rather than activation of a limited number of defense-related genes. Expression patterns of a number of defense-related genes. Expression patterns of a number of selected genes were examined in northern blot analyses. It is notable that the clone 630 of unknown function exhibits expression pattern similar to those of previously known PR-genes. Experiments to elucidate the roles in defense mechanism of a couple of genes newly identified in this study are in progress.

• 미생물학회지
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• 제32권1호
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• pp.47-52
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• 1994

Campylobacter jejuni에 48${\circ}C$의 열충격을 30분간 주었을 때, HSP90, HSP66, HSP60의 열충격 단백질들이 합성되었고, 이 단백질들은 각각 E. coli의 hsp87, HSP66 (DnaK), HSP58(GroEL)에 상응하는 단백질들이었다. 여러가지의 제한효소로 처리한 C. jejuni의 chromosomal DNA에 E. coli의 groEL(4.0kb)을 probe로 사용하여 Southern hybridization한 결과, 이들과 상동성을 가지는 유전자들이 있음을 확인하였다. C. jejuni의 groEL 유전자를 pWE15 cosmid를 이용하여 recombinant plasmid pLC1을 만들고, 이를 E. coli B178 groEL44 ts mutant에 형질전환시켜 E. coli LC1을 얻었다. 이 pLC1에는 groEL 유전자가 존재하는 5.7kb인 insert DNA가 포함되어 있었고, 그로부터 subcloning한 pLC101에는 groEL을 포함하는 4.0kb의 DNA가 삽입되어 있었다. 이 recombinant plasmid들이 형질전환된 E. coli LC1과 LC101 균주에서는 C. jejuni의 GroEL 단백질이 과다 생산되었다. C. jejuni의 groEL이 cloning된 E. coli LC1은 42${\circ}C$에서의 생장능력이 회복되었고, ${\lambda}$ vir phage에 대한 감수성도 회복되는 등의 chaperon 효과가 입증되었다.

• 생명과학회지
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• 제12권4호
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• pp.496-503
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• 2002

곤충에서 유래한 항균 펩티드, defensin을 항균활성이 있는 활성적인 형태로 분비하는 Pichia 균주를 개발하기 위한 일환으로서 MF$\alpha$1 prerpo sequence와 defensin 합성유전자를 pichia 발현 벡터에 재조합하여 형질전환하고 아미노산 histidine을 첨가하지 않은 최소 배지에서 형질전환체를 일차적으로 선별하였다. 선별한 형질전환체를 대상으로 항생제 G-418에 대한 내성과 M. luteus를 시험균으로 사용하여 생육환 저해를 통한 defensin의 세포 외 분비를 조사하여 4 균주를 선택하고 분석하였다. Southern hybridizaion을 통해 숙주의 염색체 DNA에 삽입한 defensin 유전자가 유지됨을 확인하였으며 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR을 수행하여 defensin mRNA를 증폭하고 Southern hybridization을 실시한 결과 증폭된 밴드는 probe로 사용한 defensin 유전자에 의해 양성 신호가 나타났다. 배양시간에 따른 4 균주의 세포성장과 항균활성을 비교하기 위해 BMMY 배지에서 96시간 배양하였다. 세포성장은 모두 유사한 양상을 보였다. 세포성장은 48시간 동안 급격하게 증가한 후 그 이후로는 정지기에 도달되었다. 항균활성도 48시간까지 급격히 증가하였으며 항균활성이 가장 높은 형질전환체 균주 3는 72시간 배양 시 550 AU/$m\ell$을 나타내었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권3호
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• pp.408-413
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• 2006

A strain, P821, with phospholipase D activity was isolated from soil and identified as a Streptomyces species. The phospholipase D enzyme was purified from a culture broth of the isolated strain using ammonium sulfate precipitation and DEAE-Sepharose, phenyl-Sepharose, and Superose 12 HR column chromatographies. The purified enzyme exhibited an optimum temperature and pH of $55^{\circ}C$ and 6.0, respectively, in the hydrolysis of phosphatidylcholine and remained stable up to $60^{\circ}C$ within a pH range of 3.5-8.0. The enzyme also catalyzed a transphosphatidylation reaction to produce phosphatidylserine with phosphatidylcholine and serine substrates. The optimum conditions for the transphosphatidylation were $30^{\circ}C$ and pH 5.0, indicating quite different optimum conditions for the hydrolysis and transphosphatidylation reactions. The gene encoding the enzyme was cloned by Southern hybridization and colony hybridization using a DNA probe designed from the conserved regions of other known phospholipase D enzymes. The resulting amino acid sequence was most similar to that of the PLD enzyme from Streptomyces halstedii (89.5%). Therefore, the enzyme was confirmed to be a phospholipase D with potential use in the production of phosphatidylserine.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.73-73
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• 2002

Nuclear transfer (NT) techniques have advanced in the last years, and cloned animals have been produced by using somatic cells in several species including pig. However, it is difficult that the nuclear transfer porcine embryos development to blastocyst stage overcoming the cell block in vitro. Abnormal segregation of chromosomes in nuclear transferred embryos on genome activation stage bring about embryo degeneration, abnormal blastocyst, delayed and low embryo development. Thus, we are evaluated that the correlations of the frequency of embryo developmental rates and chromosome aberration in NT and In viかo fertilization (IVF) derived embryo. We are used for ear-skin-fibroblast cell in NT. If only karyotyping of embryonic cells are chromosomally abnormal, they may difficultly remain undetected. Then, we evaluate the chromosome aberrations, fluorescent in situ hybridization (FISH) with porcine chromosome 1 submetacentric specific DNA probe were excuted. In normal diploid cell nucleus, two hybridization signal was detected. In contrast, abnormal cell figured one or three over signals. The developmental rates of NT and IVF embryos were 55% vs 63%, 32% vs 33% and 13% vs 17% in 2 cell, 8 cell and blastocyst, respectively. When looking at the types of chromosome aberration, the detection of aneuploidy at Day 3 on the embryo culture. The percentage of chromosome aneuploidy of NT and IVF at 4-cell stage 40.0%, 31.3%, respectively. This result indicate that chromosomal abnormalities are associated with low developmental rate in porcine NT embryo. It is also suggest that abnormal porcine embryos produced by NT associated with lower implantation rate, increase abortion rate and production of abnormal fetuses.

• 미생물학회지
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• 제40권1호
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• pp.60-64
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• 2004

Gentamicin에 저항성을 나타내는 세균을 병원 하수로부터 분리하여 aminoglycoside-(3)- N-acetyltransferase를 암호화하는 유전자인 aac(3)II의 존재여부를 dot-blot hybridization으로 조사하였다. aac(3)II유전자의 일부를 탐침으로 사용한 결과 gentamicin저항성 세균의 41% (39/95)가 이 유전자를 가지고 있었다. aac(3)II와 Tn3에서 각각 설계된 primer를 사용한 PCR 결과 aac(3)II를 가지고 있는 39개 균주 중 13개 균주가 TnS-aac(3)II구조를 가지고 있음을 알 수 있었다. aac(3)II의 상류에 Tn3를 가지고 있는 13개 균주의 gentamicin에 대한 최소억제농도는 가지고 있지 않은 균주에 비해 상대적으로 높았다. 13개 균주를 동정한 결과 5개는 Eschelichia coli, 3개는 Acinetobacter johnsonii, Enterobacter agglomerans와 Micrococcus luteus가 각각 2개, 그리고 1개의 Pseudomonas facilis로 동정되었다. 이러한 결과들은 Tn3-aac(3)II구조가 gentamicin 저항성 세균들에서 널리 분포하고 있음을 말해준다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권5호
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• pp.355-360
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• 1996

시험관내에서 합성한 오이모자이크 바이러스 RNA단편을 성공적으로 절단한 ribozyme (한국농화학회지 37: 56-63(1994))을 담배 식물체에 발현시켜 바이러스 저항성 식물체를 만들려고 하였다. 해당 ribozyme의 염기서열을 함유한 DNA 단편을 꽃양배추 바이러스 35S promoter와 nopaline 합성효소 terminator에 연결시키고 연결 부위 및 ribozyme의 염기서열을 확인하였다. 염기서열을 확인한 합성유전자를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 합성유전자를 함유한 E. coli HB101을 E. coli HB101(pRK2073)를 helper로 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와 함께 배양하는 tri-parental mating system을 이용하여 도입시켰다. Ribozyme 유전자를 함유한 Agrobacterium 세포를 담배잎 조각과 함께 배양한 후 항생제인 kanamycin을 함유한 MS 배지에서 자란 열개의 작은 식물체를 재분화하였다. 형질전환한 식물체내에 ribozyme 유전자가 존재하는지의 여부는 합성효소증폭반응(PCR)을 이용하였던바, 일곱개체가 예상된 570 염기쌍의 DNA 단편을 가지고 있었다. 이들 중 네 개체로부터 RNA을 분리하여 formamide를 함유한 agarose에서 전기영동한 후 35S-ribozyme-nos의 DNA 단편으로 Northern hybridization을 행하였던 바, 식물세포내의 nuclease에 의해 ribozyme RNA가 분해된 듯 감지 할 수 없었다. 따라서 ribozyme을 이용하여 바이러스 저항성 식물체를 얻으려면 nuclease에 의해 분해되지 않는 ribozyme이 필요할 것으로 사료된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.51-51
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• 2001

Cocaine and amphetamine-regulated transcript (CART) is a satiety factor that is regulated by leptin. It was reported that the mice intracerebroventricularly injected with CART showed behavioral changes resembled with the typical behavioral alterations found in the mice carrying disorders in the brain serotonergic (5-HT) system. Hence, this study was conducted to find out the relationships between CART and 5-HT. We first examined the mRNA levels of CART after the injections of para-chlorophenylalanine (pCPA, 300 mg/kg i.p., single injection or daily for three consecutive days) in the rat brains by in situ hybridization using the mouse CART cDNA probe cloned in our laboratory. Systemic administrations of pCPA, a potent inhibitor of tryptophan hydroxylase, the rate limiting enzyme of 5-HT biosynthesis, acutely depletes the brain 5-HT transporter (5-HTT) in the dorsal raphe nucleus (DRN), which reuptakes terminal 5-HT. Results indicated that the mRNA level of CART significantly decreased in the arcuate nucleus, paraventricular nucleus, and lateral hypothalamic nucleus by three days of daily injection with pCPA with no noticeable change detected 24 hrs after the single injection. The message levels of 5-HTT in DRN decreased in both single and three days of injections. Secondly, to investigate whether CART affect to 5-HT, mouse genomic CART gene, which is consist of 3 exons and 2 introns and mouse neurofilament light (NF-L) chain promoter were cloned. Then, we constructed neuron specific expression vector, which was transfected into HeLa cell using lipid-mediated transfection system. Expression of GFP and CART linked to NF-L-chain promoter in the transfected HeLa cell were detected by using fluorescent microscope and RT-PCR. These results confirmed normal expression of DNA constructs in vitro. Then, to increase brain specific expression of CART in vivo transgenic mice carrying CART gene controlled the deleted NF-L-chain promoter were generated by the DNA microinjection into pronuclei of fertilized embryos. Transgenic mice were detected by Southern blot. Further study is necessary to examine CART expression and 5-HTT in these transgenic mice. Therefore, these results suggest that there maybe a positive molecular correlation between CART and 5-HT in responding to the stimuli.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제50권4호
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• pp.445-456
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• 2008

텔로미어란 염색체 말단부에 TTAGGG의 반복 염기서열과 특정 단백질로 구성되어 있는 것으로 핵 내 염색체의 안정성에 작용을 하며 세포의 노화, 사멸 및 암의 발생과 관련이 있다. 텔로머레이스는 텔로미어의 길이를 일정하게 유지하기 위한 직접적 효소로서 telomeric DNA 합성에 관여하는 ribonucleoprotein이다. 본 연구에서는 한우와 Holstein종 136두를 대상으로 백혈구 세포를 이용하여 연령 별, 품종 별, 성 별 텔로미어 함량을 분석하였다. 또한 동일 연령에서 혈액, 간, 뇌, 심장, 신장 및 생식선 조직들의 텔로미어 함량과 텔로머레이스 활성도도 비교 분석하였다. Telomeric DNA의 양적분석은 양적형광접합보인법(Q-FISH)을 이용하였고, 텔로머레이스 활성도의 분석은 TRAP방법을 이용하였다. 분석 결과, 소의 백혈구 세포들에 있어 개체의 연령이 증가함에 따라 텔로미어의 함유율이 점진적이며 유의적으로 감소되는 양상을 보였고, 한우가 Holstein에 비해 텔로미어 함유율이 높게 나타나 품종 간 유의적 차이가 있었으며, 성 간에도 수컷이 암컷에 비해 유의적으로 높은 텔로미어 함유율을 나타내었다. 반면 동일 연령의 간, 심장, 신장, 폐, 혈액 세포내 텔로미어의 함유율은 차이가 없는 것으로 나타났다. 텔로머레이스 활성도는 태아의 모든 조직에서 비교적 강한 활성을 보였지만, 성 성숙이 된 18개월령에서는 생식선 조직을 제외한 나머지 조직에서 텔로머레이스 활성도는 현저하게 떨어져 조직별 세포의 증식성 특이성과 텔로머레이스 활성도간에는 밀접한 연관성이 있는 것으로 나타났다. 이상의 결과로서 세포내 텔로미어 양적 분포 양상 및 텔로머레이스 활성도를 이용하여 개체의 연령 지표 또는 생리적 표지의 개발 가능성을 제시하고 자 한다.

• 미생물학회지
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• 제31권4호
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• pp.286-291
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• 1993

수계환경에서 세균의 접합에 의해 나타난 conjugant 에서 plasmid 의 재배열과 $Km^{r}$ 유전자의 행방을 조사하기 위하여 자연계 분리균주와 유전공학적 변형균주(GMM)의 $Km^{r}$ 유전자의 전이빈도를 조사하는 동시에 3.9 kb 의 $Km^{r}$ 유전자를 DNA probe 로 사용하여 Southern analysis 를 실시하였다. $Km^{r}$ 유전자의 전이빈도는 실험실 환경에서 GMM 균주가 자연계균주(DK1) 보다 100배 더 높게 나타났으나, 무심천에서는 균주에 따라 차이가 없었다. 실험실환경에서 DK1 균주를 donor 로 하여 LB 나 FW 에서 얻은 conjugant 들은 모두 같은 수의 plasmid 를 가지고 있었으나 크기는 다르게 재배열하였다으며, $Km^{r}$ 유전자는 donor 의 R plasmid 인 pDK101 과 비슷한 위치에서 발견되었다. GMM 균주가 donor 일 때에는 180 kb 의 plasmid 가 새로 나타났으며, 특히 FW 수질에서 donor 가 DKC600 일 때는 $Km^{r}$ 유전자가 염색체에 삽입되어 있었다. 무심천의 자연계 수질환경에서는 DK1 이나 DKB701 이 donor 일 때 4개 및 8개의 plasmid 가 새로 나타났으며, $Km^{r}$ 유전자는 재배열된 4개의 plasmid 와 염색체에서 발견되었다. DKC600 이 donor 일 때는 recipient 의 작은 plasmid 가 모두 소실되었으나, $Km^{r}$ 유전자는 새로 나타난 plasmid 와 염색체에서 발견되었다. 그러므로 자연환경에서의 수질에서는 plasmid 의 재배열이 더 다양했으며, $Km^{r}$ 유전자도 다양한 크기로 재배열된 plasmid 에서 발견되었다.