돼지 백혈구(白血球) Iysosome의 n-butanol 추출물(抽出物)로 부터 DEAE-cellulose, Sephadex c-200 column chromatography 및 Polyacrylamide gel electrophoresis 로서 acid phosphatase, aryl sulfatase, ${\beta}-glucuronidase$로서 및 cathepsin D를 분리(分離)정제하고 그 성질을 조사하였다.
고등균류의 배양액 및 균사체로부터 항암작용이 있는 단백다당류의 추출 및 정제방법에 관한 실험을 구름버섯 균사배양체를 이용하고 실시하였다. 실온에서 비이온성 계면활성제인 2% Triton X-100과 함께 교반시키면서 추출했을 때 얻어진 단백다당류의 함량이 이미 사용되어 온 $100^{\circ}C$ 열수에 의한 추출방법을 통해 얻을 수 있는 것보다 더 좋았다. 그러나 4 N NaCl을 포함한 2% Triton-X-100 용액으로 처리했을 때는 추출 후 ethanol 침전과정에서 단백다당류의 침전물을 얻을 수 없었다. 열수추출과 ethanol 침전과정에서 얻어진 단백다당류의 순도를 높이기 위해 chromatography를 이용한 정제실험을 하였다. alumina와 DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex를 각각 충전제로 하여 시료를 전개시키고 280nm에서의 흡광도를 기준으로 단백질 성분의 용출을 확인하고 이들 분획에 대하여 anthrone정색반응과 625nm에서의 흡광도를 측정함으로써 단백다당류를 분리, 정제하였다. 단백다당류의 정제는 alumina를 충전제로 사용하는 것보다 DEAE-Cellulose와, DEAE-Sephadex를 충전제로 한 chromatography에 의하여 더 효율적으로 정제되었다.
Aspergillus niger가 생산하는 섬유소 분해 효소를 Sephadex G-150, DEAE-Sephadex 및 Sephadex G-75를 통해서 세개의 C.M.C 분해 효소와 2개의 고결정형(高結晶形) 섬유소 분해능을 가진 효소인 ${\beta}-1,4-D-cellobiohydrolase$로 분리하고 기질에 대한 특이성을 연구하였다. 효소의 기질에 대한 분해 특성 및 기질의 X-선 회절결과로 ${\beta}-1,4-D-cellobiohydrolase$는 무정형 섬유소에 대한 분해력은 거의 없고 주로 결정형 섬유소에 특이성이 컸다. Cx 효소와 ${\beta}-1,4-D-cellobiohydrolase$가 동시에 작용할 때는 상승효과를 보였다.
Aspergillus nidulans가 생산하는 naringinase를 DEAE-Sephadex A-25를 사용하여 이온결합법으로 고정화시키는 조건과 그 고정화효소의 성질 및 column reactor 에서의 연속 반응에 대하여 연구 검토한 것을 요약하면 다음과 같다. 고정화 효소를 조제할 때에 효소가 담체에 흡착되는 최적 pH는 6.0이었고 건조된 담체 1g에 대해 이상적인 수용성 효소의 량은 110 units이였다. 고정화 naringinase의 반응 최적 온도와 pH 는 각각 5$0^{\circ}C$와 7.0이며, 그 pH 안정성과 열 안정성은 수용성 효소보다 모두 높았다. 고정화 naringinase의 활성화 에너지는 Arrhenius plot에 의해 7.96kca1/mo1e이었고 겉보기 Km 값은 5.88$\times$$10^{-4}$M 이었다. 고정화 naringinase를 column 내에서 연속 반응시킬 때 Bar-Eli등의 Michaelis-Menten식의 적분형을 변형하여 유속과 가수분해도의 관계를 검토한 결과, 유속이 증가하면 가수분해도가 감소되었고 동시에 겉보기 Km값도 감소하였다. 또한 반응량 (colum reaction capacity)은 유속이 증가함에 따라서 서서히 감소하였다.
Penicillium sp. CB-20의 polygalacturonase 생성을 위한 최적조건은 탄소원으로 펙틴을 사용하여 16 시간 배양시 최대 활성을 나타내었으며, Sephadex G-25, G-75 및 G-150을 사용한 gel filtration과 DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50에 의 한 ion exchange chromatography를 통하여 이 효소를 약 30배 가량 정제할 수 있었고, 수율은 2.31%였다. 정제효소는 polyacrylamide gel electrophoresis에 의하여 단일 밴드로 확인 되었으며, 분자량은 SDS PAGE에 의하여 21,000 정도로 측정되었다. 효소의 결정구조는 마름모꼴을 형성하고 있었으며 아미노산 조성은 17종류로써 glutamic acid, glycine, hlstidine의 함량이 비교적 많았다.
녹두의 자엽에서 peroxidase isozyme을 $(NH_4)_2SO_4$ 침전, Sephadex G-75, DEAE-cellulose 및 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography 등으로 63배 정제하여 그 특성 및 결정구조를 조사하였다. Isozyme C는 Rm 값이 0.24로서 분자량이 50,000 dalton인 단량체였다. 이 효소의 반응 최적 PH는 o-dianisidine에 대하여 5.0, guaiacol에 대해서는 6.0, 반응 최적온도는 $70^{\circ}C$였으며 열에 대해서도 비교적 안정하였다. o-dianisidine과 guaiacol에 대한 Km 값은 각각 0.11mM, 60.98mM이었으며, isozyme C에 대한 기질과 cyanide는 경쟁적 저해형식을 나타내었다. Isozyme C는 평면상 직사각형의 결정구조를 하고 있었다.
표고버섯(Lentinula edodes) 으로부터 0.15 M NaCl 용액에 의하여 crude lectin을 추출하였으며, 황산암모늄에 의한 침전 음이온교환수지 및 hydroxyapatite 컬럼을 이용한 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 버섯균산과 균병으로 나누어 추출된 crude lectin의 양에 있어서는 균산부분이 균병부분에 비하여 2배 이상 높은 lectin을 함유하였으며, 가열한 버섯에서는 lectin의 함량 및 활성은 미처리보다 감소되었다. 건조된 균산 50 g으로부터 얻은 crude lectin은 720 mg으로서 46.03%의 수율로 얻었으며, DEAE Sephadex A-50 column에 의한 분리, 정제 후 정제된 lectin 201 mg을 crude lectin의 28% 수율로 얻을 수 있었다. Crude lectin을 정제함으로서 aspartic acid, serine, alanine 및 histidine등의 아미노산이 증가되었고, glutamic acid, glycine, leucine, tyrosine 및 methionine 등이 lectin에는 검색되지 않았다. DEAE Sephadex A-50 column의 chromatograpy를 통해 분리 정제한 활성을 지니는 lectin의 주된 부분은 Agglutinating test 결과, fraction A 및 B는 적혈구응집활성을 나타냈으며, 약 23 kDa의 분자량을 가지고 있었다. 활성을 지니는 부분을 다시 hydroxyapatite column에 의해 정제하여 얻은 LA-a와 LB-b는 각각 24 kDa과 23 kDa의 분자량을 나타냈다.
토양 분리균인 Bacillus spp.가 생산하는 inulinase를 ammonium sulfate 분획, 열처리, DEAE Sephadex Cl-6B ion exchange chromatography, Sephadex G-100 및 Sephadex G-150 gel 여과 등의 과정을 거쳐 단일 단백질로 분리 정제하였다. 정제 inulinase는 분자량이 약 56,000인 효소로서 pH6.0,$50^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며 $Co^{2+}$와 $Mn^{2+}$에 의해서 현저한 활성화 효과를 보였다. 또한 본 효소는 sucrose와 raffinose에 대해서도 높은 활성을 나타내므로 $\beta$-D-fructofuranosidase(EC 3.2.1.26)로 분류되는 exo-inulinase인 것으로 확인되었다. 한편 효소활성에 필수적인 아미노산 잔기는 tryptophan과 histidine인 것으로 분석되었으며 inulin과 sucrose에 대한 $K_m$값은 각각 $2.0 \times 1.0^[-3}M, 1.0 \times 10^[-2}M$로 산출되었다.
Clostidium botulinum type B가 생성하는 독소를 정제할 수 있는 방법을 연구하였다. 정제과정은 독소를 ammonium sulfate로 배양액에서 침전시켜 추출한후 Polymin P를 처리하여 핵산 및 기타 단백질을 최대한 제거한 후 Sephaex G-I00에서 gel fiItration을 시키고 DEAE-Sephadex로 이온교환 크로마토그래피를 시켰다. 이러한 과정으로 정제된 독소의 회수율은 17%였으며 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 결과 하나의 선을 나타내 동질성을 증명하였다. 정제된 독소의 분자량은 163,000이였으며 $\beta$-mercaptoethanol을 사용하여 환원시킨 결과 분자량 106,000과 56,000의 하위 단위체로 분리되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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