본 연구는 돼지 난포란의 활성화에 미치는 6-DMAP와 cycloheximide의 적정한 농도를 구명하고자 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 6-DMAP는 2 mM을 2시간 동안 처리하였을 때 활성화율, 난할률, 배반포 형성률은 51.2, 52.7, 25.2%로서 다른 처리구보다 유의적으로 (p<0.05) 높은 결과를 나타냈다. 2. Cycloheximide는 $5{\mu}g/ml$을 6시간 동안 처리하였을 때 활성화율, 난할율, 배반포 형성률은 47.7, 46.8, 27.3%로서 다른 처리구보다 유의적(p<0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 3. 6-DMAP와 Cycloheximide로 활성화를 유도한 후 배발달 배양액인 NCSU 23에 7일간 배양하였을 때의 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과 내부세포괴(ICM)세포수와 총세포수에서 유의적인 차이가 나지 않았다. 결론적으로 6-DMAP는 2 mM을 2시간 동안 처리, Cycloheximide는 $5{\mu}g/ml$을 6시간 동안 처리하였을 때 돼지 난포란의 활성화에 적합하다는 것으로 조사되었다.
Cycloheximide와 nalidixic acid를 각각 처리한 배지에 Aspergillus phoenicis, Rhizopus acidus, Candida albicans를 배양하는 동안에 이들 세포에서 항생물질이 DNA 합성에 어떠한 영향을 미치는 가를 대조구와 비교 분석하였다. Cycloheximide 처리구에서의 DNA 염기 함량은 A. phoenicis에서 대조구에 비해 adenine 20.4%, thymine 43.1%, cytosine 40.9%, guanine 35.3%가 감소되어 purine기, pyrimidine기가 각각 32.2%, 42.7% 억제 현상을 나타내었다. R. acidus에서는 adenine이 34.2%, thymine이 42.1%, cytosine은 38.0%, guanine은 18.1%가 감소됨으로 purine기와 pyrimidine기가 24.1%와 40.0%로 저해되었다. 그리고 C. albicans의 염기 조성은 adenine이 58.3%, thymine이 58.5%로 대조구에 비해 억제되었고 cytosine은 58.1%, guanine은 42.4%가 감소되어 purine기 46.8%, pyrimidine기 58.8%의 억제를 보여주었다. Nalidixic acid 처리구에서는 A. phoenicis에서 adenine 41.6%, thymine 47.1%, cytosine 59.3%, guanine 46.3%가 저해되어 purine기 45.6%, pyrimidine기 57.2%가 감소되었다. R. acidus에서의 염기함량은 adenine 59.1%, thymine 54.7%, cytosine 35.3%, guanine 37.4% 감소로 purine기 45.9%, pyrimidine기 44.9%가 대조구에 비해 억제 효과를 보여주었다. C. albicans에서는 adenine이 60.1%, thymine이 68.6%, cytosine이 60.7%, guanine이 40.0% 저해되어 purine기는 45.8%, pyrimidine기는 63.5% 감소현상을 보였다. 이들 3 균주의 DNA 생합성에서 purine기 보다는 pyrimidine기가 cycloheximide와 nalidixic acid에 의해 뚜렷한 저해 효과를 나타내는 것으로 조사되었다. 본 실험에서 cycloheximide보다는 nalidixic acid가 DNA 생합성에 현저한 억제작용을 하는 것으로 분석되었다.
Neurospora crassa는 성장이 끝나고 분화되는 과정에서 tyrosinase를 생산하며 아미노산류의 기질유사체, 반대사물질, 단백질 생합성 저해제 등에 의해 효소생산이 유도된다. 미생물 균체를 배양시키며 여러가지 유도물질을 사용하여 효소의 생합성을 유도시킨 결과 가장 적합한 유도물질은 cycloheximide였다. 이는 균체의 성장을 크게 저해하는 항생제의 일종이므로 효소 생합성을 최대화시키기 위한 최적의 농도가 존재하였으며, 유도물질의 농도가 일정한 경우에 효소 생산에 최적인 유도시간이 존재하였다.
본 연구에서는 전기자극 후 cycloheximide의 적정농도와 배양시간이 체외성숙된 돼지난자의 활성화에 미치는 영향을 조사하고자 실험을 수행하였다. 42~44시간 동안 체외성숙 된 난자는 0.1%의 hyaluronidase에서 pipetting으로 난구세포를 제거한 후, 1.2 KV/cm의 전압으로 전기자극만 하거나, 전기자극 후 cycloheximide 1, 5 및 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 농도에서 각각 3, 5 및 7시간 동안 배양하는 구로 나누어 활성화를 유도하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 난자의 분할율 cycloheximide 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 처리군이 86.8%로 1 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 처리군의 74.4%보다 유의적(P<0.05)으로 높았다. 배반포기 발달율은 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 처리구보다 5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 처리구에서 유의적(P<0.05)으로 높았다. 2. 전기자극 후 cycloheximide에서 배양시간의 비교에 있어서 5시간 처리한 돼지난자의 분할율(86.6%)이 3시간 동안 처리한 난자보다 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났다. 상실배의 발달율은 5시간과 7시간 동안 처리구(26.7%와 16.4%)에서 3시간 처리구(14.5%)보다 유의적(P<0.05)으로 높은 발달율을 나타났다. 3. 전기자극을 단독처리하거나 전기 자극 후 cyclohiximide를 복합처리한 돼지난자를 8일 동안 배양하였다. 전기자극 후 cycioheximide를 복합처리한 난자의 분할율(80.1%) 및 배반포기 발달율(11.6%)은 전기자극 단독처리한 난자의 분할율(77.2%) 및 배반포기 발달율(6.6%)과는 유의적인 차이가 없었다. 4. 체외성숙된 돼지난자를 전기자극 단독 또는 전기자극 후 cycloheximide 복합처리한 후 체외 발달한 배반포기 수정란의 핵 수는 각각 18.67$\pm$5.53개와 20.71$\pm$6.16개로써 유의적인 차이가 없었다. 이상의 결과를 요약하면, 전기자극을 단독처리 하거나 전기 자극 후 cyclohiximide를 복합처리한 돼지난자 발생율은 유의적인 차이가 없었으나, 전기자극 후 cycloheximide를 복합처리 할 경우에는 5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 농도로 5시간 동안 배양하는 것이 효과적으로 돼지난자의 activation을 유기할 수 있을 것으로 사료된다.
Electrical treatment has been widely used for porcine oocytes activation. However, developmental rates following electrical activation of porcine oocytes is relatively inefficient compared to other domestic animals. To investigate the effects of porcine oocytes on combined activation by both chemical and electrical treatment, in-vitro matured oocytes were activated by combined cycloheximide and electrical pulses treatment. Cumulus-free oocytes were exposed with NCSU-23 medium containing cycloheximide $(10{\mu}g/ml)$ for 0, 5, 10, 20, 30 min and then activated by electrical pulse treatment and cultured in PZM-3 for 8 days. Also effects of exposure to $6.25{\mu}M$ calcium ionophore for 2 min for cumulus-free oocytes were tested. The percentage of blastocyst formation in 10 min exposure to $10{\mu}g/ml$ cycloheximide and electrical pulse treatment was significantly increased (P<0.05) than in the control group. And exposure to $6.25{\mu}M$ calcium ionophore for 2 min with $10{\mu}g/ml$ cycloheximide for 10min and electrical pulse treatment significantly increased (P<0.05) the percentage of blastocyst developmental rates than the control group. In conclusion, activation by combined cycloheximide and electrical stimulation treatment promoted the subsequent development of porcine oocytes and improved the subsequence blastocyst development.
Bovine oocytes with compact and complete cumulus cells were cultured in 6 groups for up to 24h in TCM199 buffered with 25 mmol/1 HEPES and supplemented with 10% FCS, 1 mg/ml $17{\beta}$-estradiol, 20 IU/ml hCG. Half of the oocytes at each group cultured in the presence of $25{\mu}g/ml$ cycloheximide at different times during maturation (0, 6, 12, 18, 20, 22 h) were fixed at 24 h of maturation to examine the nuclear progression. The rests of them were inseminated with frozen-thawed spermatozoa in medium BO with 10 mg/ml BSA and 10 mg/ml heparin and fixed after additional 18-20 h culture to evaluate the sperm head transformation. When a protein synthesis inhibitor was added at the onset of the maturation, the oocytes were prevented to proceed GVBD. A few of the oocytes (16%) were able to be penetrated and sperm head decondensation was inhibited either. Addition of cycloheximide after 6-12 h of culture resulted in an increasing percentage of GVBCD (more than 80%), but the oocytes became arrested in M-I (69.2%). More than half of the oocytes was penetrated with a decondensing sperm head. Formation of male pronucleus was first obtained at 12 h of culture in the presence of cycloheximide. When cycloheximide was added from 18 h of culture onwards, nuclear progression to M-II was increasingly restored (80.4-85.5%). The proportion of male and female pronuclear formation increased from 17.9% to 46.2%. It is concluded that protein synthesis is necessary not only for GVBD and development from M-I to M-II, but also for sperm head decendensation and male pronuclear formation in bovine oocytes.
당류의 수송속도는 당류 고갈동안 증가되었고, 당류 고갈 3일째에 최대 수송속도를 보였다. 당류 고갈로 유도된 당류 수송계는 cycloheximide에 의해서 완전히 방해되었다 선천적으로 식물에서 당류 수송계는 하나이나 당류 고갈동안 유도된 포도당 수송은 포화상태를 보이고, 설탕 수송은 포화되지 않았다. 유도된 당류 수송계는 선천적인 당류 수송계와는 다른 kinetic을 보였다. 이 결과는 고등식물도 불리한 조건하에서 새로운 수송계를 유도시킬 수 있는 능력이 있음을 보여주었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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