• 한국자원식물학회지
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• 제31권6호
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• pp.684-694
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• 2018

This study describes the successful establishment of a cryopreservation protocol for Citrus limon cultivars: 'Frost Eureka limon' and 'Cook Eureka limon', using a droplet-vitrification method. The shoot tips that were excised from in vitro grown seedlings of the two cultivars were preserved in liquid nitrogen (LN) and successfully regenerated into whole plants. Excised shoot tips were pre-cultured for 1 or 2 days in 0.3 M and 0.5 M sucrose solutions at $25^{\circ}C$ and incubated in a loading solution (LS) composed of 17.5% glycerol + 17.5% sucrose in Murashige and Skoog (MS) medium for 40 min at $25^{\circ}C$. Prior to direct immersion in LN for 1 h, the shoot tips were dehydrated with plant vitrification solution 2 (PVS2) at $0^{\circ}C$ or PVS3 at $25^{\circ}C$. The frozen shoot tips were re-warmed and unloaded with 1.2 M sucrose in $\text\tiny{^1/_2}$ MS for 30 min at $25^{\circ}C$. Shoot tips were post-cultured overnight on survival medium and then micrografted onto 'trifoliate orange' (Poncirus trifoliate (L.) Raf. seedling rootstocks for recovery and to produce whole plants. The highest regrowth rates were 53.5% and 50.3% for cryopreserved shoot tips of 'Frost Eureka limon' and 'Cook Eureka limon', respectively, when pre-cultured in 0.3 M and 0.5 M sucrose concentrations in a sequencing manner, with LS and treated with PVS2 for 60 min at $0^{\circ}C$. We also investigated whether the ammonium ion concentration on post-culture medium affected the viability of the cryopreserved Citrus shoot tips. The viability of cooled samples, following culturing on woody plant media (WPM) containing $\text\tiny{^1/_4}$ ammonium nitrate overnight before micrografting, was the highest (70.3%) in 'Frost Eureka limon'. The study described here is a cost-effective and safe method to conserve Citrus fruit cultivars, for the improvement and large-scale multiplication of fruit plants and for breeding disease resistance.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제26권2호
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• pp.127-135
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• 1999

Cryopreservation is able to store the surplus pre-embryos for freezing and furthermore thawing and transfer in a subsequent cycle. Cryopreserving cells which are maintaining their viability are the very complex process. This study has been carried out in order to find the effects of cryopreservation steps, freezing media and embryonic stages on the rates of viability and development of cryopreserved mouse embryos. Female ICR mice ($6{\sim}8$ weeks old) were induced to superovulate by sequential intraperitoneal injection of 5 IU PMSG and 5 IU hCG 48h apart. Mouse embryos were collected according to its developmental stage after the injection of hCG. Embryos were cryopreserved not only by cryoprotectant step (1 step${\sim}$4 step) but also in a variety of media (HTF, IVF medium, D-PBS) and cell stage. The results were as follows: There is no clear advantage in these freezing media of rapid method, but 4 cell and 8 cell of slow method (2, 3, 4 step) have advantage in D-PBS. The development of embryos according to cell stage become greater in 8 cell stage. In the treatment steps of cryopreservation, the development of embryo to blastocyst was similar among rapid method, but the development of 4 cell and 8 cell embryos to blastocyst according to slow method was better than rapid method.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제2권1호
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• pp.63-68
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• 1998

본 연구에서는 보다 효율적인 동결 보존법을 수립하기 위하여 현재 사용되는 동결 보존액과 동결방법을 정자의 운동성 측면에서 비교해 보았다. 즉, 세 종류의 조성이 다른 동결보존액인 TYB, dithiothreitol을 첨가한 TYB+DTT, KS II 등이 동결보존 전후에 있어 운동성에 미치는 영향을 조사하였으며, 또한 vapor freezing 방법과 computerized freezer를 사용한 동결방법이 정자 운동성에 미치는 영향을 알아보았다. 정자의 분석은 현미경적 방법과 두 종류의 컴퓨터 정자 자동측정기인 SAIS와 Hamilton Thorn을 사용하여 동결 전 후의 정자 운동성과 VCL, VSL, VAP, ALH, LIN 등의 sub-motility 패턴을 측정하였다. 정액성상이 정상인 군에서 동결보존액을 비교한 실험결과는 TYB군과 TYB+DTT군, 그리고 KS II군의 융해 후 운동성이 각각 28.3%, 23.0%, 34.8%로 KS II군이 우수하였고, 동결방법을 비교한 실험에서는 vapor freezing 군과 computerized freezing 군의 융해 후 정자 운동성이 각각 27.8%, 33.2%로 유의차는 없었다. 또한 무력정자증을 보인 정액군에서는 TYB군과 TYB+DTT군, 그리고 KS II군에서 융해후 정자 운동성이 각각 13.6%, 10.0%, 18.5%로 여기 KS II군이 우수하였으며, vapor freezing군과 computerized freezing군의 융해 후 정자 운동성은 12.8%, 12.9%로 유의차가 없었다. 이상의 결과로 보아 운동성이 정상인 정액군과 무력정자증을 보이는 정액군에서 KS II를 사용해 동결하는 것이 TYB나 TYB+DTT를 사용하는 것보다 운동성 있는 정자를 회수하는데 더 효율적이며, 동결방법 측면에서는 vapor freezing 방법과 computerized freezing방법간에 큰 차이가 없음을 볼 수 있었다.

• Restorative Dentistry and Endodontics
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• 제33권4호
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• pp.332-340
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• 2008

본 연구의 목적은 흰쥐 상악 대구치를 발거하여 자기장 저속 냉동보관법을 이용하여 냉동 시 치주인대세포의 환성도 및 세포 사멸도를 MTT 검색법과 TUNEL 검사를 이용하여 측정하고자 하였다. 4주령의 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐의 상악 좌우 제1,2대 구치를 발거하여 각 군 당 12개의 쥐 치아를 MTT검색에 이용하였고 6개의 치아를 TUNEL 검사에 이용하였다. 실험군은 5개군으로 대조군은 즉시 발치군이며 4$^{\circ}C$ 냉장고에서 1주일간 보관한 냉장군, 발치 후 동해방지제 처리과정을 거쳐 -196$^{\circ}C$의 액화질소에 넣어 급속 냉동한 액화질소군, 217 mA, 60 Hz, 1 G의 자기장을 이용하여 -0.3$^{\circ}C$/min 의 속도로 -20$^{\circ}C$까지 냉동 후 -196$^{\circ}C$로 급속 냉동한 자기장군, -0.3$^{\circ}C$/min의 속도로 -20$^{\circ}C$까지 냉동 후 -196$^{\circ}C$에 급속 냉동한 저속 냉동군으로 나누었다. 보존액은 F medium을 사용했으며 동해방지제로 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)를 사용하였다. 치근면을 단위면적으로 표준화하기 위해 MTT 측정값을 Eosin 염색 후 530 nm에서 측정 한 흡광도 값으로 나누었다. TUNEL 검사 시 각 조직슬라이드에서 400배 크기의 현미경 시야에서 임의로 세 부분을 지정하여 정상 세포수와 양성 세포수를 세어 그 비율을 계산하여 각 실험군 당 평균치를 구하였다. 통계 분석을 위해 one way ANOVA를 시행하였으며 사후검정으로 Scheffe와 Tukey HSD방법을 썼으며 결과는 다음과 같다. MTT검색에 의한 흡광도를 Eosin염색 후 측정한 흡광도로 나눈 값에서는 자기장군은 즉시 발치군보다 낮은 세포활성을 보였고 (p < 0.05) 액화질소군, 저속 냉동군과는 통계적으로 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 그러나 자기장군은 액화질소군, 저속 냉동군과 함께 냉장군보다는 높은 세포 활성도를 보였다 (p < 0.05) TUNEL 검사 결과도 자기장군은 즉시 발치군보다 치주인대의 세포사멸도가 높았으나 (p < 0.05) 저속 냉동군과 액화 질소군과는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 자기장군은 냉장군보다 세포사멸도가 낮았으며 냉장군은 모든 군 중에서 세포 사멸도가 가장 높았다 (p < 0.05).

• 한국자원식물학회지
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• 제15권2호
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• pp.89-95
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• 2002

자작나무 식물유전자원의 효과적인 장기보존 방안을 구명하기 위해 동결전처리 된 겨울철 동아를 건조처리에 의해 초저온보존 시험하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 자작나무 동아는 내동성이 최고조에 달한 1월 20일경의 함수율이 42.43%로 가장 낮게 나타났다. 1월 20일에 채취한 동아를 10분간의 건조처리 와 5~-2$0^{\circ}C$까지 1분당 1$^{\circ}C$ 하강조건으로 완속동결 전처리하여 -196$^{\circ}C$의 액체질소에 초저온 보존한 경우의 세포생존율은 83.33%로 가장 이상적인 처리조건으로 조사되었다. 자작나무 동아의 시료조제는 동아에 약간의 목질부 조직을 붙여 초저온 보존하는 경우에 86.7%로 세포생존율이 높게 나타났다. 24시간 이상 액 체질소에 초저온 보존한 자작나무 동아는 40$\pm$5$^{\circ}C$의 온수 중에서 급속 해동하는 경우가 86.6%의 세포생존율을 비롯하여 60%의 식물체 재생율을 나타내어 본 실험에서 가장 효과가 좋은 것으로 조사되었다.

• Animal Bioscience
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• 제36권10호
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• pp.1530-1535
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• 2023

Objective: Semen cryopreservation result in decreased sperm parameters and fertilization ability. Sericin exhibits antioxidant activity by reducing lipid peroxidation resulting from free radicals, which can potentially improve cryopreservation outcomes. The present study aimed to examine the efficacy of various sericin concentrations supplemented with a rooster semen-freezing extender on post-thaw semen quality and fertilizing ability of sperm after cryopreservation. Methods: Semen samples were collected from 40 roosters (5 reps), then were pooled, and divided into four groups by the levels of sericin supplementation (0%, 0.25%, 0.50%, and 0.75%) in a freezing extender. Semen suspensions were loaded in medium straw (0.5 mL) and cryopreserved with the traditional liquid nitrogen vapor method. Post-thawed semen was evaluated for sperm motility, sperm viability, and lipid peroxidation. Also, the fertility test was determined. Results: The results showed that supplementation of the freezing extender with 0.50% to 0.75% sericin resulted in greater total motility and progressive motility and lower malondialdehyde levels than the other groups after cryopreservation (p<0.05). However, the viability of 0.75% decreased compared with the value of 0.50% sericin supplementation (p<0.05). Moreover, the fertility and hatchability of total eggs were significantly higher in the 0.50% sericin group than in the other groups (p<0.05). Conclusion: In conclusion, 0.50% sericin is recommended as an alternative component of the freezing extender to improve cryopreserved rooster semen.

• 한국자원식물학회지
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• 제19권3호
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• pp.385-391
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• 2006

In vitro-grown axillary buds of Melia aredarach were successfully cryopreserved by vitrification. On the MS medium supplemented with BA 1 mg/L, multiple shoots were developed within $4{\sim}5$ weeks. Plantlets of Melia azedarach were cold-hardened at $10^{\circ}C$ for a 16-hr photo-period for 6 weeks. Excised axillary shoot-tips from hardened plantlets were precultured on a solidified Murashige & Skoog agar medium (MS) supplemented with 0.7 M sucrose for 1 day at $25^{\circ}C$. Axillary shoot-tip meristems wert dehydrated using a highly concentrated vitrification solution (PVS2) for 60 min at $0^{\circ}C$ prior to a direct plunge into liquid nitrogen (LN). The PVS2 vitrification solution consisted of 30% glycerol (w/v), 15% ethylene glycol (w/v), 15% DMSO (w/v) in MS medium containing 0.4M sucrose. After short-term warming in a water bath at $40^{\circ}C$, the meristems were transferred into 2 ml of MS medium containing 1.2M sucrose for 15 min and then planted on solidified MS culture medium. Successfully vitrified and warmed meristems resumed growth within 2 weeks and directly developed shoots without intermediary callus formation. The survival rate of cold-hardened plantlets for 3 and 4 weeks was 90%. We did not find any difference in PCR-band patterns between control and cryopreserved plants. This method appears to be a promising technique for cryopreserving axillary shoot-tips from in vitro-grown plantlets of Medicinal plants.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제15권4호
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• pp.281-289
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• 2011

돼지 중간엽 줄기세포를 Dimethyl sulfoxide(DMSO), Ethylene glycol(EG), 그리고 DMSO/EG을 이용하여 세포동결을 유도한 후 적절한 동결보호제를 알아보았다. 2개월 이내 돼지 골수에서 중간엽 줄기세포를 분리하여 colony 형성 및 alkaline phosphatase(AP) 활성을 확인하고, 지방 세포로의 분화 유도에 의한 줄기세포의 능력을 확인하였다. 이들 중간엽 줄기세포의 완만 동결을 위해, DMEM에 각각 10% DMSO, 1.5M EG, 5% DMSO/0.75M EG의 동결보호제를 섞은 후 cryovial에 넣고, cryo-containe를 이용하여 $25^{\circ}C$에서 $-80^{\circ}C$까지 $-1^{\circ}C$/min 속도로 동결하였다. 일주일간 저장 후 세포의 생존률은 미동결 세포는 동결 세포군보다 유의적으로 높음을 확인할 수 있었으나, 동결 처리군 간에는 차이가 없었다. 줄기세포 유지 유전자인 Sox-2와 Nanog 발현은 동결 후 배양 시간에 따라 발현량이 증가하는 경향을 보였으나, 동결처리군 간에는 유의적인 차이가 없었다. 세포사 관련 유전자인 Bax의 발현은 모든 군에서 비슷하였다. 또한 지방, 연골 및 뼈세포 분화와 관련된 유전자의 발현은 동결 전 세포와 동결 후 세포군에서 비슷한 경향을 보였다. 이러한 결과는 돼지중간엽 줄기세포 동결함에 있어서 10% DMSO, 1.5MEG, 5% DMSO/0.75M EG 모두 적절한 동결보호제로 이용할 수 있음을 시사한다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제8권1호
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• pp.43-50
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• 2006

The goal of this research was to develop an efficient cryopreservation protocol for germplasms of yam (Diosorea batatas), that were cultivated in Korea. Comparative studies with four other cryogenic techniques and subsequent experiments for shoot regrowth were conducted. in vitro-grown shoot-apices of the D. batatas were successfully cryopreserved by encapsulation-dehydration. The maximum survival of shoot-apices could be achieved when the precultured (with 0.3 M of sucrose for one day) and encapsulated (with a 3%(w/v) Na-alginate solution) apices were dehydrated for $3.5{\sim}4\;h$ prior to direct immersion in LN (liquid nitrogen). The frequency of regrowth rate of cryopreserved apices was not decreased during 3-month storage period. The thawing method markedly affected survival of the cryopreserved apices, and thawing at $40^{\circ}C$ for 3 min produced the best results. When cryopreserved apices were post-cultured on the post-culture medium (MS), supplemented with $0.2mgl^{-1}$ of BA ($N_6$-benzyladenine) and $0.2mgl^{-1}$ of kinetin, they showed direct shooting without callusing.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2000년도 춘계학술발표대회
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• pp.321-324
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• 2000

식물세포의 장기보존방법 연구를 위하여 참당귀(Angelica gigas Nakai) 현탁세포를 이용하여 동결보존을 수행하였다. 최적의 예비성장배지로는 0.7 M sucrose를 첨가하여 6일간 배양한 것이 가장 좋았으며, 동결보호제로는 1 M sucrose, 1 M glycerol, 1 M DMSO를 혼합하여 사용하였을 때 가장 좋은 결과를 나타내었다. 동결 시에는 처음 8시간 동안 deep freezer에서 천천히 냉동을 한 후 액체질소에 넣는 것이 가장 좋은 것으로 나타났다. 또한 여러 가지 삼투압 증진제를 사용한 실험을 수행한 결과 sucrose가 가장 좋은 결과를 나타내었는데 이것은 sucrose가 삼투압 증진제 역할뿐만 아니라 cell membrane을 보호하기 때문으로 사료된다.