This study was carried out to investigate the inhibiton effects of Coprinus comatus ethanol extract of edible mushroom on liver damage in benzo(a)pyrene (B(a)P) treated mice. The activities of serum aminotransferase, cytochrome P 450 and hepatic content of lipid peroxide after B(a)P treatment were increased than those of control, but those levels were significantly decreased by the treatment of Coprinus comatus ethanol extract. Whereas, the hepatic glutathione content and glutathione S transferase activity were decreased by B(a)P treatment than those of control, but those were increased by the treatment of Coprinus comatus ethanol extract. Also the activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase after B(a)P treatment were markedly increased than those of control, but those levels were decreased by the treatment of Coprinus comatus ethanol extract. These results suggest that Coprinus comatus ethanol extract have a protective effect on liver damage by benzo(a)pyrene through the mechanisms of decreasing lipid peroxide and activities of free radical generating enzymes.
The inhibitory effect of Coprinus comatus on the mutagenicity in Salmonella assay system and SOS chromotest were studied. In Ames test, the ethanol and water extracts and the cultured mycelia fractions of Coprinus comatus did not show any mutagenicity, but the Coprinus comatus ethanol extracts showed inhibitory effects of 8 0∼90% on the mutagenicity induced by indirect mutagen of benzo(a)pyrene(B(a)P) and aflatoxin B1(AFB1) in Salmonella typhimurium TA98 and TA100. The antimutagenic effect increased with increasing concentration of the ethanol extract toward N methyl N' nitro N nitrosoguanidine(MNNG). However, the water extracts inhibited about 40∼50% against direct and indirect mutagen. The cultured mycelial filtrate of Coprinus comatus, the fractionⅡ, showed antimutagenic effect of 90% on MNNG and 25∼50% on B(a)P and AFB1. In SOS chromotest, the ethanol extracts of Coprinus comatus showed antimutagenic effect of 65∼81% on SOS function induced by 4 NQO, and the cultured mycelia fractionⅡ showed low inhibitory effect of 20∼50%.
Coprinus congregatus를 pH 4.2로 낮춘 YpSs 액체배지에 접종할 경우 세포막연관효소인 laccase가 배양 1일만에 상등액으로 대량 생성분비된다. 분비된 효소는 매우 빠르게 효소력의 감소를 보이며 전기영동상의 이동변화가 있다. 이와 같이 변화된 전기영동상을 보이는 효소단백질을 분광광도계로 분석할 경우 정제된 효소단백질과는 다른 분광 스펙트럼을 보인다.
The hyphal tip laccase of Coprinus congregatus which is a membrane-associated enzyme and shows diffdrdnt banding patterns of PAGE analysis when compared with the enzyme of liquid culture (Choi et al. 1987) has been successfully secreted to culture medium in liquid shake culture by lowering the pH of medium to 4.0. When the fungus is cultivated in YpSs(pH 4.0) liquid, only the hyphal tip laccase is found in the medium after 6 hr incubation and there is no liquid-type enzyme when examined by PAGE analysis.
먹물버섯속(Coprinus spp.)의 분자 생물학적 분류 가능성을 모색하기 위해 rDNA의 cluster중 ITS II영역을 PCR 증폭하여 염기서열을 밝혔다. 이들의 ITS II 영역은 $253{\sim}275$ 염기쌍으로 이루어져 있었으며 균주간 ITS II염기서열의 유사도는 $50.3{\sim}100%$로 나타났다. 이들의 염기서열을 이용해 분류도를 작성한 결과, Singer의 형태적 분류체계와 거의 유사한 결과를 보였으나 이들 그룹의 기준종(type species)인 C. comatus는 기타 종들과의 유사도에서 50% 수준의 저조한 상동성을 보여 주었다. 이와 같은 결과로 볼 때 이 종은 기존의 다수 학자들이 보고한 단일 계통진화를 해온 속이란 점에서는 다소 의문점을 남기었고, ITS II 영역은 종내 변이는 없는 것으로 보여지며 종내의 균주간의 변이가 밝혀진 그룹에 대해서는 종에 대한 재검토가 필요하다고 본다.
먹물버섯속 및 눈물버섯속 균류의 계통학적 유연관계 분석을 위해 rDNA의 cluster 중 ITS 영역을 Polymerase Chain Reaction(PCR)로 증폭하여 염기서열을 밝혔다. 이들의 ITS I, II 영역은 각각 $258{\sim}301\;bp,\;253{\sim}275\;bp$의 염기쌍으로 이루어져 있었으며 균주간 ITS 염기서열의 상동성은 $43.9{\sim}96%$로 나타났다. 이들의 염기서열을 이용해 분류도(tree)를 작성한 결과, Singer의 형태적 분류체계와 거의 유사한 결과를 보였으나 눈물버섯속 균류들은 먹물버섯속 내 그룹 II의 종들과 함께 분지를 형성하였고 먹물버섯속의 의기준종(type species)인 C. comatus는 조사된 다른 동일 속의 종들과의 유사도에서 50%수준의 저조한 상동성을 보여주었다. 이와 같은 결과로 볼 때 먹물버섯류가 기존의 다수 학자들이 보고한 단일 계통진화(monophyletic evolution)를 해온 속이란 점에서 의문점을 남기었고 좀더 많은 조사가 필요하겠으나 눈물버섯속 균류도 먹물버섯속 균류와 분리시키는 것보다는 동일 속으로 분류하는 것이 바람직 할 것으로 사료되었다.
Coprinus congregatus 의 염색체 DNA를 주형으로 사용하고 균류 laccase에서 잘 보존된 copper binding region의 염기서열을 primer 로 사용하여 PCR을 수행한 결과 144 bp 길이의 laccase 유전자 일부를 cloning 하였다. 이의 염기서열을 분석한 결과 다른 균류의 lacacse 와 60-69% 정도의상동성을 보였으며 추정된 아미노산 서열은 68-75%의 상동성을 보였다.
균사성 담자균의 생장을 억제하는 validamycin에 대하여 저항성을 보이는 Coprinus cinereus를 분리하고 무성생식포자의 발아율, 균사생장방식 및 actin단백질의 분포를 정상균과 비교하였다. 저항성균주는 validamycin이 있어도 무성생식포자의 발아율이 정상균의 동일조건보다 월등하며(약 20배), 정상균보다 분지를 자주하는 것으로 나타났다. 저항성균은 분지와 관계가 있는 것으로 알려진 actin의 분포가 Vm에 의하여 감소되는 정상균과는 달리 Vm에 의한 영향없이 균사끝과 균사끝 세포에 분포하는 것으로 나타났다.
Coprinus congregatus에서 laccase를 과량생성하는 변이주를 대상으로 phosphinothricin 저항성을 선택표지로 사용하여 형질전환을 수행하였다. 항생물질에 대한 저항성을 부여하는 plasmid DNA(pBARGEM 7-1)를 제한효소로 가수분해하여 원형질체에 형질전환을 수행한 결과 plasmid DNA $1{\mu}g$ 당 약 500여개의 형질전환체를 얻었다. 도입된 plasmid는 형질전환체의 chromosomal DNA에 삽입되어 있음을 Southern blot으로 확인하였다.
먹물버섯 Coprinus comatus를 yeast extract peptone dextrose 액체배지에서 배양하고 laccase의 생성 분비를 확인하였다. 이 때 분비된 laccase를 이온교환수지 방법과 전기영동 분획수집방법으로 순수하게 정제하였다. 정제된 효소단백질의 분자량은 SDS-PAGE로 분석하였을 때 약 67 kDa으로 나타났고 최적산도는 pH 4.3, 최적온도는 $25^{\circ}C$로 확인되었다. 기질 o-tolidine에 대한 Km 값은 0.45 mM, Vmax 값은 0.0132 OD/min/unit로 나타났다. 정제된 laccase를 사용하여 염료 RBBR과 Poly R-478의 탈색을 분석한 결과 배양 12시간 후에 RBBR은 49.3% 탈색되었고 poly R-478은 41.6% 탈색되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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