• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권1호
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• pp.12-20
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• 2008

세포배양 유래 생물의약품 생산 공정에서 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. MVM은 동물 세포주와 동물 세포 배양 공정에 오염되는 대표적인 바이러스이다. 세포배양 유래 생물의약품의 MVM 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 MVM 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 real-time PCR 시험법을 확립하였다. MVM에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 MVM DNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양 법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time PCR 민감도는 $6{\times}10^{-2}TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성(specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 MVM을 오염시킨 CHO 세포에서 MVM검출 시험을 실시한 결과 MVM을 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 MVM을 정량적으로 검출할 수 있었다. 또한 바이러스 필터 공정에서 MVM제거 효과를 감염역가 시험법과 비교 검증한 결과 더 높은 민감도로 빠른 시간에 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 위와 같은 결과에서 확립된 MVM real-time PCR시험법은 생물의약품 안전성 보증을 위한 세포주 검증, 생물의약품 생산 공정 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 감염역가 시험법을 대신할 수 있는 신속하고, 특이성과 민감성이 우수한 시험법임을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권1호
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• pp.34-42
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• 2008

소의 혈액, 세포, 조직, 기관 등 소 유래 물질을 원료로 사용한 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제의 경우 소 유래원료 물질에 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. BVDV는 동물세포주, 우혈청 등에 가장 흔하게 오염되는 바이러스이다. 소 유래물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BVDV안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BVDV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BVDV제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BVDV real-time RT-PCR시험법을 확립하였다. BVDV에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BVDV RNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time RT-PCR 민감도는 $1TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성 (specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BVDV를 오염시킨 CHO 세포주와 소 유래콜라겐에서 BVDV검출 시험을 실시하였다. BVDV를 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 BVDV를 정량적으로 검출할 수 있었다. 소 유래 콜라겐에서도 $10TCID_{50}/mL$까지 정량적으로 검출할 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제13권5호
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• pp.759-766
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• 2003

Recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cell lines expressing a high level of human thrombopoietin (hTPO) or its analog, TPO33r, were obtained by transfecting expression vectors into dihydrofolate reductase-deficient (dhfr) CHO cells and subsequent gene amplification in media containing stepwise increments in methotrexate (MTX) level such as 20, 80, and 320 nM. The parental clones with a hTPO expression level $>0.40\;{\mu}g/ml$ (27 out of 1,200 clones) and the parental clones with a TPO33r expression level $>0.20\;{\mu}g/ml$ (36 out of 400 clones) were subjected to 20 nM MTX. The clones that displayed an increased expression level at 20 nM MTX were subjected to stepwise increasing levels of MTX such as 80 and 320 nM. When subjected to 320 nM MTX, most clones did not display an increased expression level, since the detrimental effect of gene amplification on growth reduction outweighed its beneficial effect of specific TPO productivity ($q_{TPO}$) enhancement at 320 nM MTX. Accordingly, the highest producer subclones ($1-434-80^{*}$ for hTPO and $2-3-80^{*}$ for TPO33r), whose $q_{TPO}$ was 2- to 3-fold higher than that of their parental clones selected at 80 nM MTX, were isolated by limiting dilution method and were established as rCHO cel1 lines. The $q_{TPO}$ of $1-434-80^{*}\;and\;2-3-80^{*}\;was\;5.89{\pm}074\;and\;1.02{\pm}0.23\;{\mu}g/10^6$ cells/day, respectively. Southern and Northern blot analyses showed that the enhanced $q_{TPO}$ of established rCHO cell lines resulted mainly from the increased TPO gene copy number and subsequent increased TPO mRNA level. The hTPO and TPO33r produced from the established rCHO cell lines were biologically active in vivo, as demonstrated by their ability to elevate platelet counts in treated mice.

• 한국환경성돌연변이발암원학회지
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• 제8권1호
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• pp.1-12
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• 1988

본 연구는 Ethyl methanesulfonato(EMS) 혹은 Bleomycin(BLM)에 의해 유발된 DNA상해의 회복에 미치는 DNA 종합효소 $\alpha$ 저해제인 Aphidicolin(APC)과 DNA 종합효소 $\beta$의 저해제인 2`, 3`-dideoxythymididine 5`-triphosphate(ddTTP)의 영향을 조사하기 위하여 Chinese hamster ovary(CHO)-Kl 세포를 재료로 비주기성 DNA 합성법과 알칼리유출법 및 스칼리 자당구배침강법으로 수행하여 얻은 결과는 다음과 같다. APC와 ddTTP는 EMS에 의해 유발된 DNA 상해의 회복을 저해하여 APC 혹은 ddTTP를 처리하지 않고 배양한 실험군 보다 비주기성 DNA 합성율과 DNA 단사 절단율이 증가되었다. 한편 BLM에 의해 유발된 DNA 상해의 회복에서는 ddTTP를 처리했을 경우에만 저해되었다. 즉 BLM 처리 후 ddTTP를 후처리한 실험군의 비주기성 DNA 합성율과 DNA단사 절단율은 ddTTP를 처리하지 않은 군보다 증가되었고, BLM 처리 후 APC를 후처리할 경우에 비주기성 DNA 합성율과 DNA 단사 절단율은 APC를 처리하지 않은 군과 유사하였다. 이상의 결과들에서 EMS에 의해 유발된 DNA 상해의 회복에는 DNA 중합효소 $\alpha$, $\beta$양자가 관여하나 BLM에 의해 유발된 DNA 상해의 회복에는 중합효소 $\beta$가 관여하는 것으로 추측된다.

• KSBB Journal
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• 제14권6호
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• pp.724-730
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• 1999

본 연구에서는 인뇨에서 분리 정제한 urokinase와 유전자 재조합 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 배양액으로부터 분리 정제한 pro-urokinase의 물리화학적 특성과 혈액 내에서의 효소활성을 비교 분석하였다. Two chain form인 urokinase와 single chain form인 pro-urokinase를 각각 순수 분리한 후, electrophoresis한 결과 모두 54 kd의 단일밴드를 나타냈다. 그러나 urokinase는 환원시켰을 때 33 kd과 21 kd으로 나누어짐을 확인하였으나 gel filtration결과 분자량이 54 kd 정도임을 확인되어 용액 내에서 단일분자로 존재함을 알 수 있었다. Urokinase와 pro-urokinase가 물리화학적으로 거의 동일한 구조를 가졌다는 사실은 isoelectro focusing에 의한 pI 값이 모두 8.6으로 동일하다는 점과, 아미노산 조성을 분석한 결과 동일하다는 사실로도 알 수 있었다. N-terminal 아미노산 서열을 분석한 결과, urokinase는 이중사슬구조이므로 N-terminal이 두개 존재하여 pro-urokinase의 서열(Ser-Asn-Glu-Leu-His-Gln-Val-Pro-Ser-Asn)이외에도, 159번째의 Ile다음부터 Ile-Gly-Gly-Glu-Phe-Thr-Thr-Ile-Glu가 같은 peak로 나타남을 확인하였다. 효소활성 조사결과 pro-urokinase와 urokinase는 모두 농도 의존적으로 혈전용해 활성을 보였으나, 특이하게도 짧은 반응시간동안에는 urokinase가 동일 농도 하에서 강한 활성을 보인 반면, 2시간이 지난 오랜 반응조건에서는 pro-urokinase가 혈전용해활성을 나타내었다. Fibrinogen에 대한 분해활성을 조사한 결과, urokinase는 혈장 내 fibrinogen을 상당히 손상시키지만, pro-urokinase는 거의 영향을 주지 않아 혈전선택성이 매우 좋음을 알 수 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권2호
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• pp.142-148
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• 2004

에리스로포이에틴은 인간 적혈구분화의 조절인자로 작용한다. 유전자 재조합 인간에리스로포이에틴(rhEPO)은 동물세포에서 생산되고 있는 재조합 당단백질의 하나이며 당쇄부분이 전체 분자량의 40％를 차지한다. 시알산 함량은 체내약물 투여 지속기간과 직접적인 연관이 있어 시알산 함량은 의약용 당단백질의 중요한 성질로 여겨진다. 본 연구에서는 CHO세포 배양액에 시알산 생합성 전구물질인 N-acetylmannosamine(ManNAc)과 sialidase 저해제인 2-deoxy-2,3-hyo-N-acetylneuraminic acid(NeuAc2en)를 첨가하여 rhEPO의 sialic acid함량을 증가시킬 수 있었다. 특히, 배양액에 20 mM ManNAc/0.5 mM NeuAc2en를 첨가할 때 대조구에 비하여 약 10배의 시알산 함량이 증가하였으며 세포성장이나 배양액의 rhEPO생산량에는 영향이 없었다. rhEPO의 정제시 시알산 함량이 11∼15％인 다당쇄 rhEPO분획을 얻었으며, 배양액 내에 20 mM ManNAc와 0.5 mM NeuAc2en를 동시에 첨가함으로 대조구에 비하여 시말산함량이 높은다당쇄 rhEPO의 생산성이 50％ 증가하였다.

• 생명과학회지
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• 제23권8호
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• pp.963-969
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• 2013

비타민 C는 다양한 유전독성에 대하여 방호작용을 할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 구체적 방호기작과 방호작용의 정도는 충분히 이해되어 있지 않다. 본 연구는 독성물질 및 환경의 조작에 의해 세포의 유전체가 손상되는 조건에서 비타민 C가 발휘하는 유전독성 방호효과를 정량하고, 그 방호기작을 분석하였다. Chinese hamster ovary 세포(CHO-K1)를 사용한 Comet assay를 수행하여, $H_2O_2$, $HgCl_2$, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO)와 자외선에 노출된 세포의 DNA 손상 정도를 측정하였다. 비타민 C 방호효과를 측정한 결과, $H_2O_2$, $HgCl_2$, 4NQO를 비타민 C와 함께 처리한 경우, DNA 손상이 대조군 수준으로 감소하였다. 자외선의 경우 비타민 C의 방호효과가 나타났으나 대조군 수준까지 미치지 못하였으며, MNNG의 경우 비타민 C가 전혀 방호하지 못하는 것으로 나타났다. 또한, 비타민 C를 유전독성노출 이전에 처리한 세포들의 DNA 손상 정도가 독성노출 이후에 처리된 경우보다 28~49% 낮은 것으로 측정되었다. 이는 독성노출 이전 시점에 도입된 비타민 C가 세포외액과 세포질에 존재하여, 이후에 도입되는 유전독성물질과 직접적으로 작용하며, 강력한 항산화제로써 1차적인 항산화작용을 담당함을 시사한다. 그러나 MNNG의 경우처럼 비타민 C가 방호효과를 보이지 않는 유전독성물질이 존재하므로, 유전독성물질의 독성기작에 따라 비타민 C의 방호효과는 제한되는 것으로 나타났다. 따라서, 각 유전독성물질의 독성기작과 비타민 C의 방호기작과의 상호작용에 대한 연구가 필요하며, 비타민 C의 항산화 방어 기작(antioxidant defense mechanism)의 다양성에 대한 규명이 이루어져야 할 것으로 사료된다.

• 한국식품과학회지
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• 제31권3호
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• pp.823-830
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• 1999

배양 CHO cell에 SCE법을 이용하여 실제로 음용하는 조건에서 추출한 시판 감잎차, 녹차, 우롱차 추출물의 돌연변이 억제효과를 보기 위하여 실험하였다. 돌연변이 물질로 사용한 MMC에 의하여 유발된 SCE 빈도에 미치는 각 차 추출물의 돌연변이 억제 효과를 본 결과, 감잎차는 MMC 처리 후 S9 mix와 함께 고농도$(1000\;{\mu}g/mL)$로 세포에 처리되었을 때 SCE 빈도를 유의하게 감소시켰다. S9 mix 없이 감잎차 추출물만을 후처리한 경우는 저농도$(20{\sim}80\;{\mu}g/mL)$에서 SCE 유발빈도를 유의하게 감소시켰다. 우롱차는 MMC처리 후 S9 mix와 함께 저농도$(10{\sim}20\;{\mu}g/mL)$로 처리 시 SCE 유발빈도를 감소시키는 효과가 있었으며, 녹차는 MMC 처리 후 S9 mix와 함께 추출물 농도 $160\;{\mu}g/mL$로 처리 시 SCE 유발빈도를 감소시키는 효과가 있었다. 감잎차, 녹차, 우롱차 모두 농도는 다르나 각 추출물을 S9 mix와 함께 세포분열 주기 중 G1기에 후 처리 되었을 때에 SCE 빈도를 감소시키는 효과가 있었으며, 감잎차는 S9 mix 없이 단독으로 후처리 되었을 때에도 용량 상관성은 없지만 SCE 빈도를 감소시키는 효과가 있었다. 결론적으로, 시판 감잎차, 녹차, 우롱차 추출물에는 MMC로 유발된 돌연변이를 억제시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었으며, 감잎차의 경우 S9 mix 없이도 SCE 빈도를 감소시키는 효과가 있었던 것으로 보아 다른 두 차와는 다른 기전의 돌연변이 억제 작용을 하는 성분이 있는 것으로 사료된다.

• KSBB Journal
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• 제22권2호
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• pp.109-113
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• 2007

본 연구에서는 FSH를 생산하도록 유전자 조작된 CHO 세포의 저온배양이 세포성장과 FSH의 생산에 미치는 영향을 알아보았다. 28$^{\circ}C$에서 배양하였을 때 세포의 성장은 억제되었으나 37$^{\circ}C$에서의 배양에 비하여 세포생존율이 더 오랫동안 높게 유지되었고 최대 FSH의 양도 14배 증가하였다. 28$^{\circ}C$에서의 회분식 배양의 경우 배지에 15 mM의 GB를 첨가하였을 때 최대세포농도와 FSH 양은 GB를 첨가하지 않았을 때에 비하여 각각 11%, 17% 증가하였다. 28$^{\circ}C$에서의 유사배지 교환식 배양의 경우 15 mM의 GB를 포함하는 배지를 교환하였을 때 세포생존율이 GB를 포함하지 않는 배지를 교환하였을 때에 비하여 더 높게 오랫동안 유지되어 최종적으로 배양기간을 4일간 더 연장할 수 있었다. 이러한 배양기간의 연장으로 인하여 15 mM의 GB를 포함하는 배지를 교환하는 유사배지 교환식 배양에서 총 $2,058{\mu}g$의 FSH를 얻었고 이는 GB를 포함하지 않는 배지를 교환하는 유사배지 교환식 배양에 비하여 1.4배 증가한 것이다. 본 연구를 통하여 저온배양에 있어서 배지에 GB를 첨가함으로써 CHO 세포에서의 재조합단백질 생산을 증대시킬 수 있다는 것을 알았다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제26권1호
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• pp.1-12
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• 2022

This study aimed to investigate the signal transduction of phosphorylation sites at the carboxyl (C)-terminal region of equine luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor (eLH/CGR). The eLH/CGR has a large extracellular domain of glycoprotein hormone receptors within the G protein-coupled receptors. We constructed a mutant (eLH/CGR-t656) of eLH/CGR, in which the C-terminal cytoplasmic tail was truncated at the Phe656 residue, through polymerase chain reaction. The eLH/CGR-t656 removed 14 potential phosphorylation sites in the intracellular C-terminal region. The plasmids were transfected into Chinese hamster ovary (CHO)-K1 and PathHunter Parental cells expressing β-arrestin, and agonist-induced cAMP responsiveness was analyzed. In CHO-K1 cells, those expressing eLH/CGR-t656 were lower than those expressing eLH/CGR wild-type (eLH/CGR-wt). The EC₅₀ of the eLH/CGR-t656 mutant was approximately 72.2% of the expression observed in eLH/CGR-wt. The maximal response in eLH/CGR-t656 also decreased to approximately 43% of that observed in eLH/CGR-wt. However, in PathHunter Parental cells, cAMP activity and maximal response of the eLH/CGR-t656 mutant were approximately 173.5% and 100.8%, respectively, of that of eLH/CGR-wt. These results provide evidence that the signal transduction of C-terminal phosphorylation in eLH/CGR plays a pivotal role in CHO-K1 cells. The cAMP level was recovered in PathHunter Parental cells expressing β-arrestin. We suggest that the signal transduction of the C-terminal region phosphorylation sites is remarkably different depending on the cells expressing β-arrestin in CHO-K1 cells.