포유동물의 성숙한 난포의 난포액 속에는 여러 종류의 단백질 분해효소가 있으며 이들은 난포의 형성과 퇴화 및 난자의 성숙과 배란 등의 다양한 변화에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 난포액 속의 단백질 가수분해효소 중에는 serine proteinase가 비교적 잘 알려져 있으나 다른 효소 특히, caseinolytic enzyme에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 사람의 난포액을 재료로 하여 caseinolytic enzyme의 존재 여부 및 동 효소의 특성을 알아보고자 하였다. 사람의 난포액과 혈청 그리고 사람의 제대혈을 $\alpha$-casein을 기질로 하는 zymography 방법으로 분석 한 결과 분자량 80 kDa의 매우 강한 caseinolytic activity를 지니는 효소 단백질과 분자량 78 kDa의 비교적 약한 caseinolytic activity를 갖는 단백질 등 두 개의 caseinolytic enzyme이 관찰되었다. 이 caseinase들의 특성을 알아보기 위해 phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), soybean trypsin inhibitor(SBf), 1,10-phenanthroline, E-64 그리고 ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)를 zymouaphy의 substrate buffer에 처리한 결과 EDTA와 SBTI에 의해서 80 kDa와 78 kDa caseinase의 활성이 억제되었다 이로 미루어 80 kDa와 78 kDa caseinase는 trypsin-like enzyme인 것으로 추측된다. 한편 사람 난포액의 zymouaphy 수행시에 5 mM의 EDTA가 첨가된 substrate buffer에 CaC $l_2$, MgC $l_2$, MnC $l_2$ ZnC $l_2$를 각각 0에서 10 mM의 농도별로 처리한 결과 모두 5 mM 농도에서 가장 높은 caseinase 활성을 보였다. 금속 이온의 첨가없이 EDTA만 처리한 대조군의 경우 caseinase의 활성은 나타나지 않았다. 이로 미루어 80 kDa 및 78 kDa caseinase는 효소 활성을 위해 이가 금속 양이온을 필요로 하는 것으로 여겨진다.
A strong fibrin-specific fibrinolytic enzyme was produced from Bacillus subtilis KH-4 isolated from Deonjang, a Korean fermented soybean paste similar to Japanese miso. The addition of glucose as a carbon source resulted in the highest levels of caseinolytic and fibrinolytic activities. Likewise, the addition of yeast extract as the nitrogen source resulted in the highest caseinolytic and fibrinolytic activities (3473.2 unit and 47.4 munit, respectively), It was observed that out of all metal ion sources only calcium (chloride) enhanced caseinolytic and fibrinolytic activities, with increases of 4949.3 unit and 58.2 unit/mg, respectively. The optimal temperature for the production of the enzyme was found to be 4$0^{\circ}C$ in the optimal medium (glucose 20 g, yeast extract 5 g, CaCl$_2$l g, and NaCl 2 g). The maximum fibrinolytic activity was observed at the late stationary phase. B. subtilis KH-4 produced a fibrinolytic enzyme at 4$0^{\circ}C$, after 30 h growth, which increased up to 54 h and then remained constant. These results suggest that Deonjang has potential as a source of physiologically active anti-thromotic enzymes.
Human adult stem cells have widely been examined for their clinical application including their wound healing effect in vivo. To function as therapeutic cells, however, cells must represent the ability of directed migration in response to signals. This study aimed to investigate the mechanism of platelet-derived growth factor (PDGF)-induced migration of the human abdominal adipose-derived stem cells (hADSCs) in vitro. A general matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor or a MMP2 inhibitor significantly inhibited the PDGF-induced migration. PDGF treatment exhibited greater mRNA level and denser protein level of MMP1. The conditioned medium of PDGF-treated cells showed a caseinolytic activity of MMP1. Transfection of cells with siRNA against MMP1 significantly inhibited MMP1 expression, its caseinolytic activity, and cell migration following PDGF treatment. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor reduced the migration by about 50% without affecting ERK and MLC proteins. Rho-associated protein kinase inhibitor mostly abolished the migration and MLC proteins. The results suggest that PDGF might signal hADSCs through PI3K, and MMP1 activity could play an important role in this PDGF-induced migration in vitro.
There are several factors in the degradation of textiles. The crucial factors in textile weakening are humidity, dust, smoke, sunlight, microorganisms and so on. Especially silk fabrics are more susceptible to microorganisms than other fabrics, because they are mainly consisted of proteins. In this study, we investigated the activities for degrading casein and silk fibers with 2 strains, Bacillus cereus TX1 and Pseudomonas fluorescens TX 2, isolated from domestic museums. They were compared to those of standard control strains, Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus, usually used for the antibiotic test of fabrics. The caseinolytic activities of K. pneumoniae and S. aureus were higher than those of isolated strains. But in the cases of silk fiber degrading, B. cereus TX 1 showed the highest activity on both silk 1 and silk 2. Therefore, caseinolytic activities were not coincident with the activity to degrade silk fibers. All strains degraded silk 1(strength retention 100%) better than silk 2(strength retention 50%). It means that bacteria mainly participate in the early stage of degrading silk fabrics, but as time goes by, the importance of bacteria for degrading silk fabrics would decreased. Even though the importance of bacteria may decrease, controlling bacterial activity is necessary to preserve historic silk fabrics.
Effect of iron on the extracellular proteolytic activity of live Uronema marium was determined by fluorescence polarization (FP) method. Supplementation of 0.5 and 5.0 μM iron significantly increased caseinolytic activity of live U. marinum. In contrast, supplementation of 50 μM iron showed no significant differences in FP values compared to the control. The present result suggests that iron in cultured water or skin tissue of olive flounder may influence on the penetration and establishment of U. marinum, correlating with modulation of extracellular protease activity of the ciliates.
The changes in components and biological activities of doenjang samples prepared with black soybeans and fermented with Bacillus subtilis SCB were investigated. The amino nitrogen (A-N) contents of samples increased with increasing black soybean content. A doenjang product made using a 1:1 ratio of soybeans-black soybeans showed a maximum level of genistein and daidzein isoflavones ($1111.6{\mu}g/g$) at 110 days of fermentation, along with decreasing contents of genistin and daidzin due to the conversion to aglycones. The black soybean-only doenjang sample showed higher protease activity, including caseinolytic and fibrinolytic enzyme activities, than the other samples, and had relatively higher polyphenol content and DPPH radical scavenging activity. Therefore, doenjang made with additions of black soybeans and fermented by B. subtilis SCB may have improved physiological properties, suggesting this to be a valuable method of preparation.
Aeromonas hydrophila는 수생계에 흔히 존재하는 병원체로서 출혈성 패혈증, 수종, 궤양 등의 질병을 유발한다. A. hydrophila는 효과적인 감염과 다양한 환경에서 적응하기 위해 세포 외 물질(Extracellular products, ECPs)을 분비한다. 본 연구에서 사용한 A. hydrophila CK257은 매우 독성이 강한 균주로 균이 분비하는 ECP 역시 쥐, 토끼, 금붕어를 포함한 동물 모델에게 조직 손상을 일으키며 독성을 보였다. 이러한 괴사 반응을 일으키는 원인 요소를 찾기 위해 ECP의 특성을 분석하였고 그 결과, 원인 요소가 단백질이라는 것을 확인하여 이후 단백질 분리 및 정제에 초점을 맞추어 실험을 진행하였다. 균체를 제거한 배양액 상의 분비 단백질을 얻기 위하여 ammonium sulfate 침전법을 사용하였고, 이후 겔 거르기 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)를 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제 후 단백질은 다섯 개의 분획으로 나뉘었고 이 중 한 개의 분획이 동물 모델에 괴사와 같은 피부 손상을 일으키는 것을 확인하였다. 괴사 활성을 가진 분획의 단백질 4개의 밴드를 MALDI-TOF 시스템을 통해 분석한 결과, Peptidase M35와 Peptidase M28로 밝혀졌으며 이들은 각각 금속촉매효소(metalloprotease)임을 확인할 수 있었다. Peptidase M35와 Peptidase M28의 단백질 분해 효소로써의 기능을 확인하기 위해 카제인 분해 활성을 확인하였고, 다양한 금속 이온을 처리함에 따라 그 활성이 달라지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 조직에 존재하는 단백질의 한 종류인 엘라스틴(elastin) 분해능 역시 확인해 보았다. 본 연구에서는 A. hydrophila가 분비하는 물질 가운데 조직 괴사 활성을 일으키는 것으로 추정되는 Peptidase M35와 Peptidase M28의 두 가지 인자를 확인하여 동정하였다. 이후 두 가지 인자를 결손 시킨 돌연변이주를 구축하여 조직 괴사에 이들이 직접적으로 작용하는지 확인 할 예정이다.
Park, Sung-Sun;Oh, Sung-Hoon;Choi, Won-Dai;Ra, Kyung-Soo;Suh, Hyung-Joo
Preventive Nutrition and Food Science
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제12권4호
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pp.234-241
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2007
A physicochemical assessment of Doenjang (traditional fermented soyfood) prepared with Korean black soybeans (Glycine max) was carried out. The T-N rate increased slowly during storage up to 120 days and the A-N rate increased up to 80 days of ripening and then decreased slightly. The caseinolytic activity increased slowly during storage up to 80 days and then decreased after 80 days. In addition, the fibrinolytic and ${\beta}-glucosidase$ activities increased up to 80 and 30 days and then decreased. Genistin and daidzin concentrations gradually decreased with increased fermentation time. However, genistein and daidzein slowly increased with fermentation time. Genistein and daidzein reached maximum concentrations (316.8 and $305.2{\mu}g/g$, respectively) and plateaued thereafter. The anthocyanins increased greatly during fermentation up to 50 days and then remained constant between 50 and 90 days. Polyphenol contents showed a slight increase up to 80 days and then slowly decreased. The DPPH and ABTS radical scavenging activities increased linearly during storage up to 50 days, reached about 28.9% and 2.17 mg/g, respectively, and then slowly decreased. At 20 days of fermentation, macrophage-stimulating activity of the extract showed a maximum activity.
Kwon Se Ryun;Kim Chun Soo;Ahn Kyoung Jin;Cho Jae Bum;Chung Joon Ki;Lee Hyung Ho;Kim Ki Hong
Fisheries and Aquatic Sciences
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제5권3호
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pp.145-149
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2002
The effects of pH, temperature and various inhibitors on the proteolytic activity of the cell lysate of Uronema marium were investigated using colorimetric and substrate gel electrophoretic methods. The cell lysate of U. marinum showed proteolytic activity over a wide range of pH, and pH optima ranged from pH 5 to 7. The proteolytic activity was increased according to a rise of temperature but decreased at $40^{\circ}$. The proteolytic activity of the parasite lysate was significantly inhibited by protease inhibitors including trans-epoxysuccinyl -L-leucylamido-(4-guanidino) butane (E-64), pepstatin A, phenyl-methanesulfonyl fluoride(PMSF), and ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA). Preincubation of the lysate with E-64 showed the maximum inhibition of the caseionolytic activity. Four protease bands (152, 97, 67 and 40 kDa) were detected by gelatin SDS-PAGE. Significant inhibition of caseinolytic activity and complete abolition of a 152 kDa band in gelatin SDS-PAGE by EDTA indicated that the cell lysate of U. marinum had a metalloprotease Another three proteolytic bands were inhibited by E64, a cysteine protease inhibitor. Preincubation of the cell lysate with pepstatin or PMSF had no effects on the protease bands.
Artemia franciscana의 cyst에서 protease를 정제하가 위해 세포를 파쇄하여 원심 분리한 후 상등액을 회수하였다. 그상등액에서 40-60% 황산암모늄을 첨가하여 침전시켜서 염을 제가한 후, Sphadex G-200 및 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography를 하여 정제한 후 본 효소의 특성을 조사한바 그 특성은 아래와 같았다. 정제 과정을 거치는 동안, 비활성은 13.64배 증가하였고, 수율은 7%였다. 그리고 이효소는 pH 6에서는 안정하였으나, pH 8이상에서는 대부분의 활성이 실활 되었고, 최적 pH는 3.0이었다. 따라서 이 효소는 전형적인 산성 pro-tease로 판정되었다. 본 효소는 60$^{\circ}$C이상의 온도에서 대부분 실활 되었고, 최적 활성 반응 온도는 35$^{\circ}$C였다. 금속 이온의 영향을 알아본 결과, $Cu^{++}$, Z$Zn^{++}$, $Fe^{++}$가 효소의 활성을 저해하였고, 중금속 chelator인 EDTA는 반대로 효소 활성을 증가시켰다. 단백질분해효소에 특이적인저해제를 첨가하여 실험한 결과 thiol protease ingibitor인 antipain, chymostatin, leupeptin, E-64, iodoacetate등에 효과적으로 효소활성이 저해받으므로 본 효소는 acid thiol protease라 판정했다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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