유제품, 김치 및 신생아 분변 등에서 유산균을 분리하여 우유 casein을 분해시켜 배양상등액에 존재하는 serine의 함량을 측정함으로써 간접적으로 CPP 생산을 평가하였다. CPP 생산 능력은 OPA방법으로 측정했을 때 E. faecalis A-2 균주가 1.244 mg/mL로 가장 많은 peptide를 생산 하였다. 본 실험에 사용된 유산균의 경우, 세포내 효소와 세포외 효소로 각각 나누어 proteolytic 활성을 평가한 결과 세포내 효소에 의한 proteolytic 활성은 E. faecalis A-6 균주가 가장 높은 것으로 나타났으며, 세포외 효소에 의한 proteolytic 활성은 L. plantarum A-14 균주에서 가장 높게 나타났다. 가용성 칼슘함량은 Leuconostoc mesenteroides A-1(11 mg/dL), E. durans A-16(10.481 mg/dL), 그리고 L. planatarum A-3(10.356 mg/dL) 균주의 경우에는 대조구보다 높은 유리 칼슘함량을 나타내었다. 따라서 이러한 유산균을 이용한다면 소장 내에서 칼슘 흡수를 극대화시킬수 있는 장점이 있어 이들 유산균을 이용한 고칼슘 제품 개발이 가능할 것이다.
본 연구는 생리활성 casein phosphopeptide의 경제적인 생산방법과 CPP의 칼슘 가용화 능력을 검정하기 위하여 수행되었다. 먼저 정제된 CPP-III는 N 13.1%, P 2.3∼2.4%, N/P비 5.4∼5.6 정도로 CPP 순도가 매우 높은 것으로 나타났다. 경제적인 면을 고려하여 CPP-III보다는 순도가 떨어지는 CPP-I, CPP-II의 제조방법을 확립하였다. 한편 CPP의 칼슘가용화 능력을 생리적 pH 조건하에서 검정한 결과 CPP와 polygutamic acid는 Ca 침전 형성 저지효과가 현저하였으나, DPP는 효과가 없었다.
For the production of Casein Phosphopeptide(CPP) inhibiting the insolubility of calcium, 10% sodium caseinate was treated with 1.5% of protease from Streptococcus sp.. Optimal conditions and productivity for the CPP production, and properties of the CPP were compared with tryptic hydrolysates of sodium caseinate. Optimum conditions of pH, temperature and reaction time were 8.0, 50C, 4 hrs, respectively. Under these conditions the productivity of CPP was 23% and Molecular weight of CPP was ranged from 3, 000 to 17, 000. The results also showed that the insolubility of calcium was completely inhibited by using 1.5 times of CPP for the amount of calcium.
Phosphorylation plays the most important role in cell signaling mechanism. Various methods to identify the phosphorylation sites of proteins using tandem mass spectrometry (MS/MS) have been reported recently. Furthermore, the enrichment strategy such as Titanium dioxide ($TiO_2$) method should be combined with MS/MS analysis to effectively identify phosphorylation sites. It is necessary to optimize phosphopeptide-enrichment strategy, $TiO_2$ method in this study, due to the low amount of phosphorylated form followed by analyzing them by MS/MS. To evaluate the several conditions to enrich phosphopeptides using $TiO_2$ method, we used ${\apha}$-casein as a standard phosphoprotein and analyzed a representative phosphopeptide (VPQLEIVPNpSAEER) peak of MS spectrum. Batch is better than column method for binding and 300 g/l DHB in loading buffer is better than lower concentration of DHB. 3% TFA and pH 10.5 shows high efficiency of phosphopeptide-enrichment for washing and elution steps, respectively. Finally we identified various efficient conditions of phosphopeptide-enrichment method using $TiO_2$. This optimized method would assist in reliable identifying thousands of phosphorylation sites existed in low abundance from various complex proteins.
본 연구에서는 전국 가정집에서 제조한 김치로부터 분리한 유산균들 중에서 protease 활성 및 CPP 생산 능력이 가장 높은 균주인 strain 0301을 동정하였고 해당 균주의 특성과 CPP 생산 최적 조건을 조사하였다. 0301은 $0.6-0.8{\mu}m$ 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다. E. faecalis MG-379 균주를 2% fructose를 첨가하고 pH 6.0인 배지에서 37oC에서 36시간 배양하였을 때 CPP 생산 능력이 최대였으며, ICP를 이용하여 측정한 결과 2227.5 mg/kg으로, 비교 균주인 Enterococcus faecalis KCCM 40450에 비해 약 2배 가량 높은 CPP 생산 능력을 갖는 것으로 나타내었다.
Although offline enrichment of phosphorylated peptides is widely used, enrichment for phosphopeptides using $TiO_2$ is often performed manually, which is labor-intensive and can lead to irreproducible results. To address the problems associated with offline enrichment and to improve the effectiveness of phosphopeptide detection, we developed an automated online enrichment system for phosphopeptide analysis. A standard protein mixture comprising BSA, fetuin, crystalline, ${\alpha}$-casein and ${\beta}$-casein, and ovalbumin was assessed using our new system. Our multidimensional system has four main parts: a sample pump, a 20-mm $TiO_2$-based column, a weak anion-exchange, and a strong cation-exchange (2:1 WAX:SCX) separation column with LC/MS. Phosphorylated peptides were successfully detected using the $TiO_2$-based online system with little interference from nonphosphorylated peptides. Our results confirmed that our online enrichment system is a simple and efficient method for detecting phosphorylated peptides.
본 연구에서는 CPP와 CSO를 사용하여 약 187~282 nm 크기의 균일한 구형의 나노 복합체를 성공적으로 제조하였다. 나노 복합체는 제조 공정 요인인 CPP 농도와 pH 조절을 통해 입자 크기, 다분산 지수, 그리고 표면 전하와 같은 나노 복합체의 물리화학적 특성을 조절할 수 있음을 확인하였다. 또한 CPP/CSO 나노 복합체의 분말화 공정을 통해 분말화 된 나노 복합체의 식품 적용성을 증진시킬 수 있음을 알 수 있었으며, food-grade 물질인 CPP와 CSO를 사용하여 제조한 나노 복합체는 향후 잠재적인 칼슘 전달체로써 식품 산업에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 실험은 산란종계 노계에서 이소플라본과 CPP의 첨가 급여가 종란 생산성 및 후기 난각질에 미치는 영향과 Ca 대사에 미치는 영향을 검토하기 위한 목적으로 실시하였다. 56주령의 Hy-Line Brown 산란종계 암탉 360수와 수탉 36수를 공시하여 사료 내 Ca을 3.3% 및 3.6% 수준으로 하고 이소플라본과 CPP를 각각 0.2% 및 0.5% 수준으로 첨가한 총 6개의 실험사료(3반복)를 5주간 급여하였다. 주별로 사료섭취량을 조사하였고, 산란율과 난중은 매일 조사하였다. 주별로 생산된 종란으로부터 종란율과 부화율을 조사하였다. 실험사료 급여 후 생산된 계란을 반복구별로 수집하여 난각질 및 난각막 내 glycosaminoglycan과 uronic acid 분석에 이용하였다. 실험 종료 시 반복구별로 평균체중이 비슷한 개체를 선발하여 채혈 후 희생시킨 다음 경골을 적출하였다. 채취한 경골은 화학적 조성의 분석을 위한 시료로 이용하였고, 얻어진 혈액에서 화학성분 및 호르몬 분석을 실시하였다.사료섭취량, 난생산성 및 종란율에서는 처리간에 유의한 차이가 없었다. 사료 내 Ca 수준 및 이소플라본 첨가는 난각강도를 각각 유의하게 개선시킨 것으로 나타났으며, CPP의 첨가에 의해서는 특별한 변화가 관찰되지 않았다. 수정율 및 부화율에서도 처리간에 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. 경골강도 및 경골 내 성분 조성에서 사료 내 Ca 수준 및 이소플라본과 CPP의 첨가 효과는 발견되지 않았다. 혈중 Ca, P, estrogen 및 calcitonin 농도 역시 처리간에 차이가 없는 것으로 나타났다. 본 실험에서는 사료 내 Ca 수준의 증가 및 이소플라본 같은 Ca의 이용성에 영향을 미치는 성분을 적절히 활용함으로서 후기 난각질의 개선을 통해 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 종란 생산성에 대해서는 이소플라본 및 CPP의 첨가가 크게 영향을 미치지 않았다.
Although considerable effort has been devoted in the mass spectrometric analysis of phosphorylated peptides, successful identification of multi-phosphorylated peptides in enzymatically digested protein samples still remains challenging. The ionization behavior of multi-phosphorylated peptides appears to be somewhat different from that of mono- or di-phosphorylated peptides. In this study, we demonstrate increased sensitivity of detection of multi-phosphorylated peptides of beta casein without using phosphopeptide enrichment techniques. Proteinase K digestion alone increased the detection limit of beta casein multi-phosphorylated peptides in the LC-MS analysis almost 500 fold, compared to conventional trypsin digestion (~50 pmol). In order to understand this effect, various factors affecting the ionization of phosphopeptides were investigated. Unlike ionizations of phosphopeptides with minor modifications, those of multi-phosphorylated peptides appeared to be subject to effects such as selectively suppressed ionization by more ionizable peptides and decreased ionization efficiency by multi-phosphorylation. The enhanced detection limit of multi-phosphorylated peptides resulting from proteinase K digestion was validated using a complex protein sample, namely a lysate of HEK 293 cells. Compared to trypsin digestion, the numbers of phosphopeptides identified and modification sites per peptide were noticeably increased by proteinase K digestion. Non-specific proteases such as proteinase K and elastase have been used in the past to increase detection of phosphorylation sites but the effectiveness of proteinase K digestion for multi-phosphorylated peptides has not been reported.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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