칼슘/calmodulin-의존적 단백질 인산화 효소 II (CaMK-II)는 세포의 여러 기능을 조절하는 다양한 단백질들을 인산화시키는 효소이다. 세포 내부의 칼슘의 농도는 세포의 주기에 따라 변하므로 CaMK-II의 활성도 역시 세포주기에 따라 변하는 지를 조사함으로 세포주기에서의 CaMK-II의 역할을 알아보려 하였다. NIH3T3 세포를 CaMK-II의 활성도에는 전혀 영향을 주지 않는 여러 가지 약제로 처리하여 세포주기상의 특정한 시점에 동일하게 정지시킨 후, 세포내의 CaMK-II 활성도를 합성 펩타이드기질을 이용하여 측정하였다. 또한 일정 시점으로부터 동조화된 세포내의 CaMK-II의 활성도의 변화를 측정하여 한 세포주기 동안 효소의 활성도 변화의 양상을 조사하였다. 세포주기상 각각 G0, G1, G1/S, G2/M기에 정지된 세포내의 CaMK-II 총활성도는 대조군과 차이가 없었으나 M기에서는 낮았다. 그러나 자가인산화에 의한 CaMK-II의 칼슘-비의존성 활성도는 M기에서 가장 높았다. 이러한 양상은 G1기에서부터 동조화된 세포내 CaMK-II의 칼슘-비의존성 활성도 변화 양상과도 일치하였다. CaMK-II의 생리학적 의미를 지닌 활성도는 인산화에 의한 calcium-비의존성 활성도임을 비추어 볼 때 M기에서 CaMK-II가 세포분열의 과정에서 중요한 기능을 하고 있음을 보여주고 있다.
녹차의 주성분인 에피갈로 갈레이트 (EGCG)는 건강에 이로운 효과로 나타내고 있는것으로 알려져 있어 많은 주목을 받고 있는 실정이다 본 연구에서는 처음으로 EGCG가, U87사람의 교세포에서 포스포리파제 D의 효소활성을 증가시킨다는 사실을 규명하였다. EGCG에 의한 포스포리파제 D의 활성화는 포스포리파제 C효소의 특이적인 억제제와 지질분해효소 활성이 억제제 포스포리파제 \gama1$의 변이체를 이용하여 실험한 결과 세포내 칼슘에 의존적인 양상을 보였주었다. 이러한 포스포리파제 D의 활성화는 아마도 칼슘 의존성 단백질 키나아제 II (CaM kinase II)를 통하여 일어나는것으로 여겨진다. 흥미롭게도, EGCG는 포스포리파제 \gama1$를 세포질에서 세포막으로의 이동을 유도하였으며, 포스포리파제 \gama1$와 PLD1의 결합을 유도하였음을 관찰하였다. 이상의 결과들을 종합하여 볼 때, EGCG가 사람의 교세포에서 포스포리파제 \gama1$-칼슘-CaM kinase II의 신호전달 경로를 통하여 포스포리파제 D의 활성을 유도하는 것으로 사료된다.
Although the blockage of a cell cycle by specific inhibitors of $Ca^{2+}/$calmodulin-dependent protein kinase II (CaMK-II) is well known, the activity profile of CaMK-II during the cell cycle in the absence of any direct effectors of the enzyme is unclear. The activity of native CaMK-II in NIH 3T3 cells was examined by the use of cell cycle-specific arresting and synchronizing methods. The total catalytic activity of CaMK-II in arrested cells was decreased about 30% in the M phase, whereas the $Ca^{2+}$-independent autonomous activity increased about 1.5-fold in the M phase and decreased about 50% at the G1/S transition. The in vivo phosphorylation level of CaMK-II was lowest at G1/S and highest in M. The CaMK-II protein level was unchanged during the cell cycle. When the cells were synchronized, the autonomous activity was increased only in M. These results indicate that the physiologically relevant portion of CaMK-II is activated only in M, and that the net activation of CaMK-II is required in mitosis.
수용체작동약물과 GTP에 의한 수축단백질의 칼슘이온의 감수성의 증가에 대하여 $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent protein kinase II의 역할을 ${\alpha}$-독으로 처리한 토끼장간막동맥에서 조사하였다. $0.3\;{\mu}M$의 칼슘이온은 마이오신의 인산화를 시간의존적으로 증가시켰고 5분 이후부터 평형에 도달하였다. 한편, $10\;{\mu}M$의 norepinephine과 $10\;{\mu}M$의 GTP는 칼슘이온 존재하에 칼슘이온 단독에 의한 것 보다 더 마이오신의 인산화를 증가시켰는데, 5분 후에 최대에 달하였고 그 후는 감소하기 시작하여 20분 후에는 칼슘이온 단독에 의한 마이오신 인산화 증가와 거의 차이가 없었다. $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent protein kinase II 억제제인 KN-62를 전처치하여 norepinephrine과 GTP에 의한 마이오신 인산화 증가의 변화를 경시적으로 관찰하였다. $10\;{\mu}M$ KN-62는 1분에서 norepinephrine과 $10\;{\mu}M$ GTP에 의한 마이오신의 인산화의 증가를 억제하였다. 그러나 5분에서 관찰되는 norepinephrine과 GTP에 의한 마이오신 인산화의 증가의 최대치에는 영향이 없었고 그 이후에도 KN-62는 아무 영향을 끼치지 못하였다. 이상과 같은 결과로 볼때 norepinephrine과 GTP에 의하여 일어나는 평활근 수축단백의 칼슘이온의 감수성의 증가는 이미 알려진 바와 같이 마이오신 인산화의 증가에 기인하며 이 증가는 일과성임을 확인하였다. 이때 $Ca^{2+}$/calmodulin-dependent protein kinase II의 역할은 시간의존적으로 norepinephrine과 GTP의 자극 초기에 관여되는 것으로 생각되며 그 이후에는 관여가 없는 것으로 사료된다.
Genistein has been reported to potentiate glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Inhibitory activity on tyrosine kinase or activation of protein kinase A (PKA) was shown to play a role in the genistein-induced potentiation effect on GSIS. The aim of the present study was to elucidate the mechanism of genistein-induced potentiation of insulin secretion. Genistein augmented insulin secretion in INS-1 cells stimulated by various energygenerating nutrients such as glucose, pyruvate, or leucine/glutamine (Leu/Gln), but not the secretion stimulated by depolarizing agents such as KCl and tolbutamide, or $Ca^{2+}$ channel opener Bay K8644. Genistein at a concentration of $50{\mu}M$ showed a maximum potentiation effect on Leu/Gln-stimulated insulin secretion, but this was not sufficient to inhibit the activity of tyrosine kinase. Inhibitor studies as well as immunoblotting analysis demonstrated that activation of PKA was little involved in genistein-induced potentiation of Leu/Gln-stimulated insulin secretion. On the other hand, all the inhibitors of $Ca^{2+}$/calmodulin kinase II tested, significantly diminished genistein-induced potentiation. Genistein also elevated the levels of $[Ca^{2+}]_i$ and phospho-CaMK II. Furthermore, genistein augmented Leu/Gln-stimulated insulin secretion in CaMK II-overexpressing INS-1 cells. These data suggest that the activation of CaMK II played a role in genistein-induced potentiation of insulin secretion.
Change in intracellular $Ca^{2+}$-concentration ($[Ca^{2+}]_i$) is an essential event for egg activation and further development. $Ca^{2+}$ ion is originated from intracellular $Ca^{2+}$-store via inositol 1,4,5-triphosphate receptor and/or $Ca^{2+}$ influx via $Ca^{2+}$ channel. This study was performed to investigate whether changes in $Ca^{2+}$/calmodulin dependent protein kinase II (CaM KII) activity affect $Ca^{2+}$ influx during artificial egg activation with ethanol using $Ca^{2+}$ monitoring system and whole-cell patch clamp technique. Under $Ca^{2+}$ ion-omitted condition, $Ca^{2+}$-oscillation was stopped within 30 min post microinjection of porcine sperm factor, and ethanol-induced $Ca^{2+}$ increase was reduced. To investigate the role of CaM KII known as an integrator of $Ca^{2+}$- oscillation during mammalian egg fertilization, CaM KII activity was tested with a specific inhibitor KN-93. In the eggs treated with KN-93, ethanol failed to induce egg activation. In addition, KN-93 inhibited inward $Ca^{2+}$ current ($I_{Ca}$) in a time-dependent manner in whole-cell configuration. Immunostaining data showed that the voltage-dependent $Ca^{2+}$ channels were distributed along the plasma membrane of mouse egg and 2-cell embryo. From these results, we suggest that $Ca^{2+}$ influx during fertilization might be controlled by CaM KII activity.
세포막 정보전달 과정에 참여하는 효소로 inositol triphosphate($InsP_3$)를 분해하는 $InsP_3$ kinase를 소의 뇌 조직으로 부터 새로운 정제방법을 개발하고 isozyme들의 특성을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 분쇄한 소의 뇌조직을 PEG로 단백침전하고 DEAE cellulose chromatography 하여 $InsP_3$ kinase I, II의 두 isozyme을 얻었으며, 각각의 isozyme 분획을 Matrix green gel 및 calmodulin-Affigel 15 column으로 chromatography하였다. Phenyl-TSK HPLC하여 정제하였으며 I은 3,103배, II는 2,310 배의 정제를 나타내었다. 정제 단계에서 specific activity를 비교해 볼 때 Matrix green gel chromatography가 DEAE cellulose에서 보다 I이 30배, II가 약 2.3배로 나타났고 정제배수도 I이 17.2%에서 62.1%로 II가 16.6%에서 38%로 나왔으나 calmodulin-Affigel 15과 비교시는 큰 차이가 없었다. 그러므로 Matrix green gel이 정제에서 매우 중요한 단계라 할 수 있다. 효소의 분자량을 알기 위하여 DEAE HPLC로 두 개의 isozyme을 분리하여 전기영동한 결과 I은 환자량 145,000, 85,500 및 69,500이 3개의 단백질을 얻었고 II는 분자량 79,000 및 57,000의 2개의 단백질을 얻었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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