막의 특성을 이용하여 기질과 효소가 공존하는 캡슐을 제조하여 이 캡슐의 장점인 membrane의 pore size를 조절하면 올리고당을 분자량별로 유출시키는 것이 가능해짐으로 기질과 효소의 유출을 조절하여 생리활성이 높은 올리거당을 얻고, 생산된 올리고당의 단순한 분리.정제를 위하여, 그리고 효소의 재 이용 측면에서 encapsulation technology를 이용하여 올리고당을 생산하는 연구를 하였다. 제조된 capsule의 막 두께와 직경은 Olympus IX50 microscope를 이용하여 측정한 결과 막의 두께는 10 $\mu$m이었으며, capsule의 크기는 대략 3.0mm, $N_2$ gas를 이용할 capsule은 대fir 1.5 mm였다. 본 실험에 사용된 기질의 용액, 효소액, 반응액, alginate 용액을 pH 5.0으로 제조하여 사용하였기 때문에 막이 보다 견고하게 형성 할 수 있었으며, 제조된 capsule를 반응 용액 즉 2% acetic acid의 pH를 CaCO$_3$로 조절한 용액에 넣었기 때문에 막이 단단하게 형성되고 유지되는 것으로 판단된다. 기질의 사용에 있어서 작은 분자량을 갖는 기질은 효소와 분해 반응에 있어서 가수분해가 빨리 일어나기 때문에 보통 capsule 밖으로 유출된 올리고당의 분자량은 평균 M.W. 1,000이었다. 그러나 분자량이 큰 기질을 사용하였을 경우 평균 M.W. 1,000-3,500이었다. 막을 이루는 alginate의 점도에 의한 차이는 없었으며, 교반 속도에 의한 기질과 효소의 유출, 그리고 분해 반응에 따른 가수분해 산물인 올리고당의 유출에 있어 alginate 농도 0.5%, 교반 속도는 40 rpm이 가장 적당하였다. (12). Capsule에서 분해 반응 후 분해 산물인 올리고당의 이동을 빨리 하기 위하여 작은 size의 capsule를 제조하여 실험한 결과 3.0 mm보다 capsule 내부의 분자량 변화가 더 빨랐으며, capsule 밖으로 유출된 올리고당의 분자량 분석 결과 M.W. 3000-6000의 올리고당이 생성되었다. 반응 시간에 따른 capsule 내부의 잔류 효소 활성을 조사한 결과, 반응 8시간째에도 약 80% 이상의 효소활성을 나타내었다. Batch-type과 비교하여 capsule의 경우에는 반응이 끝난 후 capsule를 회수하여 효소를 재 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 미세조류의 고밀도 배양을 위한 경제적인 공정을 개발하는 차원에서 3종의 미세조류 즉, Chlorella vulgaris, Dunaliella salina 및 Porphyridium purpureum를 Ca-alginate 로 microencapsulation 한 후 air-bubble column형 배양조에서 고밀도 배양을 시도하였다. $2\%\;CaCl_2$ 농도로 capsule을 제조할 때 capsule의 안정성이 가장 좋았으며, capsule 막의 두께 및 $CO_2$ 공급유무에 따른 미세조류 (Chlorella vulgaris)의 생산성은 거의 차이가 없었다. 한편, 3종의 미세조류 모두 capsule로 고정화시킨 것이 bead로 고정화한 미세조류나 free cell 보다 농도가 높았으며, 특히Dunaliella salina가 microencapsulation에 의한 고밀도 배양 효과가 가장 뛰어나 free cell 보다 약 5배 정도의 생산성을 나타내었다.
To easily separate chitosanoligosaccharides by size exclusion, an coencapsulating technology of substrate and enzyme was developed. The membrane was composed of alginate and a divalent cation such as calcium. Chitosan and chitosanase were enveloped in this membrane and the product released to medium by size exclusion. The capsule was stabilized in a 2% acetic acid solution (pH 5.0) containing 0.145 M CaCO$_3$. The leakage of substrate caused by the agitation speed was controlled by increasing alginate and CaCO$_3$concentrations. The lower limit of the alginate concentration and the agitation speed were 0.5% and 49rpm, respectively. Membrane thickness and capsule diameter were 10$\mu\textrm{m}$ and 2.5mm, respectively. By TLC analysis, the composition of chitosanoligosaccharides were mainly 3-6 mers. The molecular weight distribution of the released oligosaccharides ranged from 262 to 3624 Da by GPC.
Proteolytic bacteria isolated from fermented anchovy jeotkal were immobilized in capsule type with $0.8\%$ sodium alginate and $CaCl_2/carboxymethyl$ cellulose (CMC). For making the immobilized capsule, the optimal concentration of both $CaCl_2$ and CMC, with respect to the membrane hardness and the growth of proteolytic bacteria in capsule, were $2.0\%$ at following conditions: flow rate of $CaCl_2/CMC$ solution and cell suspension were respectively 3.54 ml/min and 0.15 ml/min when inside diameter of inner and outer capillary tube in immobilizing apparatus were 0.32mm, 0.74mm, respectively. The density of proteolytic bacteria in capsule reached maximum, i.e. $10^8-10^9cells$/capsule during culture under optimal conditions in TPY broth, and these were $10^2-10^4$ times higher than these of before culture. During culture of proteolytic bacteria immobilized in capsule type (PBImC) for 72hrs, few growing cells were lost in the outer medium.
본 실험에서는 레몬 오일을 함유한 알긴산 칼슘 마이크로캡슐을 에멀션-내부 젤화법으로 제조하였으며, 방출실험을 통하여 아로마테라피의 가능성에 대해 살펴보았다. 적외선분광분석(FT-IR)과 시차주사열량계(DSC)를 통해 레몬 오일의 봉입 여부를 확인하였고, 제조된 마이크로캡슐의 직경 및 형태를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하였다. 제조된 마이크로캡슐은 평균 $4\~7$um직경 및 $50\~85\%$의 캡슐화를 보였으며, $37^{circ}C$에서 적외선 수분계(IMDB)를 통한 방출실험 결과. 알긴산 및 $CaCl_2$의 농도가 증가할수록 가교밀도가 증가하므로 레몬 오일의 방출률이 감소함을 관찰할 수 있었다. 또한, 물리적 압력을 통한 방출실험을 실시함으로써, 캡슐벽의 붕괴와 방출속도가 외부적인 요인에 의해 방출속도를 제어할 수 있음을 확인하였다.
생균력 안정성이 보장되고 품질이 규격화된 농용 미생물제공급을 위하여 캡슐형 미생물제의 캡슐화 소재로 열수 추출법과 알칼리 추출법을 이용하여 다시마로부터 Na-alginate를 직접 추출하여 겔 형성능과 생균력을 검토하였다. 열수추출 alginate(HWEA)의 경우 5%의 고농도에서 겔 형성이 성공적으로 이루어진데 반해 알칼리추출 alginate(ASA)는 3% 농도에서 $992.1\;{\pm}\;0.2\;g/cm^2$의 강한 겔이 형성되는 특성을 보여 시판되고 있는 alginate(CA) 1.5% 농도의 겔과 유사한 겔 형성능을 나타내었다. 또한 ASA의 경우 추출 수율이 20%로 HWEA 보다 2배 이상 높게 나타났으며 현재 시판되고 있는 Na-alginate(CA)에 비해 비용이 11배 이상 저렴한 것으로 산출되었다. 이상의 결과로부터 ASA를 사용할 경우 값싼 비용으로 추출이 용이하며 저농도에서 겔형성능이 우수하여 최적의 농용 미생물 캡슐소재로 평가되었다. ASA 캡슐제의 생균력을 조사한 결과 81%의 생균력을 나타내어 고가의 CA 캡슐제와 동일한 생균력을 보장 할 수 있음이 입증되었다. 미세 캡슐 내 미생물 생존력을 보다 안정적으로 유지하기 위해 캡슐막의 효과를 나타낼 수 있는 보조제로 starch와 zeolite를 이용하여 생균력 증진효과를 검토한 결과 단일소재 ASA만으로 제조된 캡슐제보다 보조제를 혼합한 캡슐제 경우 세균과 효모는 생균수가 크게 증가되는 효과를 볼 수 있었다. 미생물 혼합 배양액과 상기의 최적 복합 캡슐소재를 혼합하여 캡슐화한 미생물제의 생균력을 측정한 결과 세균은 93%의 높은 생균력을 나타내었고 유산균과 효모의 경우 70% 이상의 생균력을 나타내어 본 연구를 통해 다시마로부터 직접 추출한 ASA가 고가의 시판품 alginate를 대체할 수 있는 농용 미생물 캡슐화 소재로 이용가능할 것으로 판단되었다.
바이오 고분자인 알긴산 나트륨(Sodium Alginate)을 이용하여 기존의 방법에 비해 생산성이 우수한 캡슐화의 상업화 공정을 개발하고자 하였다. 또한, 동일 공정으로 키토산을 알긴산과 함께 캡슐화하여 알긴산 나트륨으로 캡슐화 된 유산균과 비교하였다. 유산균 캡슐화의 상업화 공정의 주요 공정은 캡슐화 후 기존의 동결건조 대신에 본 연구진이 개발한 생산성이 우수한 유동화 건조 방법에 의하여 건조시간을 15~24이상 단축할 수 있었지만, 생균수는 동결건조와 유동층 건조의 비율이 1:0.75로 동결건조 방법이 좋았다. 하지만 건조에 드는 비용과 시간을 고려 해 볼 때 유동층 건조 방법으로 상업화 공정이 가능함을 확인할 수 있었다. Chitosan-alginate 캡슐은 알긴산 칼슘캡슐과 생균수를 비교하였을 때, 알긴산을 이용한 캡슐은 희석배수 $10^{-9}$, 즉 약 $1{\times}10^9$ 마리 이상의 균이 존재하고, 키토산을 이용한 캡슐은 희석배수 $10^{-3}$, 즉 약 $1{\times}10^3$ 마리의 균이 존재함을 확인 할 수 있었다. 본 연구의 기술로 제조된 유산균 캡슐은 pH 4.65, 6.01에서 96시간 이상 동안 안정하였지만, pH 7.07, 8.35에서는 1시간 이내에 모두 붕해되었다. 이는 유산균 캡슐이 위산에서 안정성을 보이고 pH 7이상을 띠는 소화기관인 소장과 대장에서는 쉽게 붕해가 일어날 수 있음을 알 수 있었다.
본 연구에서는 생균제로서의 L. fermentum YL-3의 미세캡슐화를 시도하였고, 균체에 대한 캡슐 재료의 영향을 조사함으로써 캡슐제조시 균에 대한 손상을 최소화하고자 하였다. 그리고 제조된 캡슐의 내산성과 저장성을 조사하여 유산균의 내산성과 저장능의 증진에 적합한 캡슐의 제조 및 보존 방법을 연구하였다. 먼저, 인체에 무독성인 sodium alginate를 캡슐의 원료로 선택하여 microcapsule을 제조한 결과 생균제가 alginate 캡슐에 포집되어 존재하는 것을 확인할 수 있었고, pH 2에서 120-126 ${\mu}m$ 크기의 견고한 캡슐을 제조하였으며, pH가 증가할수록 크기가 커지지만 pH 3 이상에서는 견고성이 너무 떨어져 캡슐의 형성이 어려워 오히려 pH 3에서의 캡슐보다 작은 형태를 나타내었다. 반면, 캡슐 후의 생균제의 생존율은 pH가 증가할수록 높게 나타났다. 그리고 캡슐제조시 사용되는 재료가 균체에 미치는 영향을 조사한 결과 캡슐의 주재료인 sodium alginate와 $CaCl_{2}$는 균의 활성을 떨어뜨리는 것으로 조사되었고, 그 외의 재료인 sodium citrate, Tween 80, Span 80, soybean oil은 균의 활성에 별다른 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 또한 microcapsule과 macrocapsule을 제조하여 각각의 캡슐의 내산성과 저장성을 비교한 결과, 내산성은 microcapsule이 가장 우수한 것으로 나타났고, 저장성은 $4^{\circ}C$에서는 microcapsule, $25^{\circ}C$에서는 macrocapsule에서의 생균제 활성이 좋은 것으로 확인되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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