• 제목/요약/키워드: C3 cleavage

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동결보호제의 종류 및 배발달단계가 OPP Vitrification 동결보존시 생쥐수정란의 생존성에 미치는 영향 (Effect of Cryoprotectant Kinds and Cell Stages on the Viability of Mouse Embryos Cryopreserved by OPP Vitrification)

  • 공일근;조성균;조성근
    • 한국가축번식학회지
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    • 제23권1호
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    • pp.85-92
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    • 1999
  • 본 연구는 동결동결보호제의 종류와 배발달단계가 생쥐의 OPP vitrification 동결방법에 미치는 영향을 알아보고자 실시하였다. 동결속도, 동결보호제 및 배발달단계는 vitrification 방법에 따른 수정란의 생존성에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구에 사용된 동결보존액은 40% (v/v) ethylene glycol, 18% (w/v) Ficoll, 0.3 M sucrose와 5% FCS가 첨가된 D-PBS (EFS) 및 16.5% ethylene glycol, 16.5% dimethyl sulfoxide, 0.5 M sucrose 와 5% D-PBS (EDS)을 이용하였다. 배반포기배는 hCG 처리후 90시간째에 자궁으로부터 채취하여 실험 1에 이용하였고, 실험 2와 3에서는 zygote 를 hCG 처리후 18시간에 난관에서 채취하여 mHTF 배양액에 5% $CO_2$, 37$^{\circ}C$ 조건하에 배양하면서 2-, 4-, 8-cell, compacted morula, 또는 blastocyst를 이용하였다. 실험 1에서 배반포기배의 적당한 동결보존액을 결정하기 위하여 EFS 또는 EDS로 OPP vitrification 을 실시하였다. 재확장배반포기에 의한 생존율은 대조군과 EDS 처리군 (100, 100%) 이 EFS 군 (95.0%) 보다 유의적 (P<0.05)으로 높게 나타났으나, 부화배반포기에서는 EFS 군 (90.0%) 이 대조군 (100%) 및 EDS 군 (95.0%) 보다 유의적으로 낮은 발달율을 보였다. 실험 2에서는 zygote, 2-, 4-, 8-cell, 상실배 빛 배반포기 등의 초기배에서도 OPP vitrification 동결방법이 적당한지를 판단하기 위하여 실시하였다. Zygote (70.0%) 는 동결융해 후 배발달율이 2, 4, 8, 상실배 및 배반포기배에 비하여 유의적으로 낮은 발달율을 보였다 (89.7, 90.0, 92.8, 97.6 및 97.5%) (P<0.05). 또한 동결융해란의 할구수에서는 대조군 및 배반포기배 (35.7$\pm$2.98 및 39.6$\pm$2.81)에서 zygote, 2-, 4- 8-cell, 상실배 (29.8$\pm$3.21, 31.3$\pm$3.83, 29.3$\pm$3.58, 28.9$\pm$3.21 및 30.8$\pm$2.93) 보다 유의적으로 높게 나타났다 (P<0.05) 실험 3에서는 zygote의 VS1 에 노출시간에 따른 생존율을 조사한 결과 융해후 2-cell (91.6, 88.5 및 88.9%) 및 배반포기 (83.3, 74.3 및 69.4%) 까지 배발달율은 1,2 및 3분간의 노출시간에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 융해후 노출시간에 따른 할구수에서도 유의적인 차이를 보이지 않았다 (36.4$\pm$4.76, 32.4$\pm$4.67 및 27.6$\pm$4.52). 이상의 결과에서 OPP vitrification 방법은 EFS 또는 EDS 동결보존액에 따른 유의적인 차이 없이 이용될 수 있는 것으로 판단된다. 배발달단계에 따른 생존율은 zygote 의 초기배는 2, 4, 8, 상실배 및 배반포기보다 유의적으로 저조한 생존율을 보였다. Zygote의 VS1에 노출시간에 따른 생존율도 1 분간의 노풀시간에서 높은 배발달율을 보였다. OPP vitrification 동결보존방법으로 생쥐수정란의 동결보존에 유용하게 이용가능한 것으로 판단된다.

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외래유전자 도입정자를 이용한 돼지 체외성숙 난포란의 Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) 후 후기 배로의 발달율과 외래유전자의 발현에 관한 연구 (Development and Expression of Porcine Embryos by Direct Injection of Sperm Treated with Exogenous DNA)

  • 정기화;조성근
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제17권1호
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    • pp.45-53
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    • 2002
  • 본 연구는 sperm-mediated gene transfer를 이용하여 ICSI에 의한 형질전환동물 생산의 기초자료로서 활용하기 위해, ICSI에 사용될 정자의 조건과, 그에 따라 적합한 돼지 정자와 외래유전자의 전처리 및 ICSI를 통한 수정을 및 후기 배로의 발달율과 외래유전자의 발현 여부를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. ICSI에 이용될 정자의 조건에 따라 정소상체미부정자, 사출정자 및 동결정자를 이용하여 ICSI후 수정율은 각각 72.3%, 64.1% 및 74.1%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 또한 후기배로의 발달율에 있어서도 각각 17.6%, 18.7% 및 15.0%로 나타나 각 처리군간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그리고, ICSI후 전기적 자극을 실시한 군과 실시하지 않은 군에서 난자의 활성화에 따른 수정율은 대조구로 이용한 shame injection과 전기적 활성화를 실시하지 않은 군에서 각각 47.1%와 46.3%로 나타나 전기적 활성화를 실시한 군의 79.6%에 비해 유의적인 차이를 나타내었다. 후기배로의 발달율에 있어서도 전기적 활성화를 실시한 군에서는 24.1%로 나타나 전기 적 활성화를 실시하지 않은 군에서의 14.4%와 유의적인 차이를 나타내었다. 그리고 대조구로 이용한 shame injection에 있어서 후기 배로의 발달율은 2.5%로 낮은 결과를 나타내었다. 또한, 정자와 pcDNA LacZ유전자의 처리시 electroporation 방법을 실시하여 ICSI후 난자를 각각 전기적 활성화를 실시한 군과 실시하지 않은 군에 있어서 유전자 발현율은 각각 30.2%와 24.2% 나타났으나, 두 처리군간에 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나, 두 군에서 pcDNA LacZ 유전자는 모두 mosaic 발헌 양상을 보였다. 이상의 실험 결과들을 종합해 보면, ICSI에 사용될 수 있는 돼지의 정자는 정소상체미부정자, 사출정자 및 동결정자 모두가 이용 가능하며, ICSI후 추가 전기적 자극에 의한 난자의 활성화가 수정율과 후기 배로의 발달율을 향상시킬 수 있음을 시사하였다. 따라서, 돼지에 있어서 정자의 외래유전자 도입에 대한 정확하고 실용적인 방법은 보고되고 있지는 않은 상태로, 정자와 외래유전자의 처리법을 향상시키기 위하여 다양한 방법으로 많은 연구가 요구된다.

백화사설초(白花蛇舌草) 메탄올 추출물(抽出物)의 항종양(抗腫瘍) 효과(效果) 및 항암(抗癌) 기전(機轉)에 관(關)한 연구(硏究) (Study of Hedyotis Diffusa Methanol Extract on Anti-tumoral Effect and Mechanism)

  • 노훈정;문구;문석재;원진희;문영호;박래길
    • 대한한방종양학회지
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    • 제6권1호
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    • pp.81-97
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    • 2000
  • Objectives: This experimental study was carried out to evaluate the effects of aqueous and methanol extracts of Hedyotis diffusa which has long been used for cancer treatment in oriental medicines on the induction of apoptotic cell death in human lymphoid leukemia cell line, HL-60. Methods: Cells were treated with various concentrations (200 to $0.4{\mu}g$) and periods (6 to 30 hr) of $H_2O$ and methanol extracts of Hedyotis diffusa. Then, cells were tested for viability by MTT assay. Cells wrere treated with $200{\mu}g/ml$ of methanol extract fork various periods. Genomic DNA was isolated, separated, on 1.5% agarose gels, stained with ethidium bromide and visualized under UV light. Cells were treated with $200{\mu}g/ml$ of each extract for 16 hr. Then, cells were treated with Hoechst dye 33342 and observed by fluorescence microscopy. Cells were treated with various doses of each for 12 hr and $100{\mu}g/ml$ of methanol extract for various periods. Lysate from the cells used to measure the activity of Caspase-1 and-3 proteases by using fluorogenic peptide substrates including acetyl-YVAD-AMC and acetyl-DEVD-AMC, respectively. Cells were treated with $200{\mu}g/ml$ of each extract for various periods. Cell lysates were immunoprecipated with anti-JNKl antibodies. The immune complex was reacted with $32^p-ATP$ and c-Jun as a substrate. The phosphotransferase activity of JNKI was measured by using PhosphoImage analyzer (Fuji Co., Japan). Nuclear extracts were isolated and incubated with oligonucleotide probe of $NF-{\kappa}B$. Transcriptional activation of ${\kappa}B$ was measured by using EMSA and visualized by PhosphoImage analyzer (Fuji Co, Japan). Cell lysates were prepared and analyzed by Western blotting with anti-Bc12 antibodies and anti-Bax antibodies. Cells were pretreated with various doses of methanol extract for 2 hr. Then, the extract was removed by centrifugation. Cells were resuspended with RPMI-1640 media containing 0.3% agarose, 10% FBS, overlayred onto bottom layer agarose and incubated at $CO_2$ incubator for 6 days. The number of colony was counted under light microscopy ($\time100$). Results: The death of HL-60 cells was markedly induced by the addition of methanol extract of Hedyotis diffusa in a dose and time-dependent manners. The apoptotic characteristic ladder pattern of DNA strand break was observed in death of HL-60 cells. In addition, it was shown nucleus chromatin condensation and fragmentation under Hoechst staining. Therefore, Hedyotis diffusa extract-induced death of HL-60 cells is mediated by apoptotic signaling processes. The activity of Caspase 3-like proteases remained in a basal level in HL-60 cells treated with aqueous extract of Hedyotis diffusa. However, it was markedly increased in HL-60 cells treated with methanol extract of Hedyotis diffusa. In addition, the phosphotransferase activity of JNKl was increased in HL-60 cells treated with methanol extract of Hedyotis diffusa. Furthermore, the activation of transcriptional activator, $NF-{\kappa}B$ was markedly induced by methanol extract of Hedyotis diffusa. Anti-apoptotic Bc12 was cleaved into 23Kda fragment by treatment of methanol extract of Hedyotis diffusa. However, expression of proapoptotic Bax protein was increased by treatment of methanol extract of Hedyotis diffusa in a time-dependent manner. Furthermore, methanol extract markedly inhibited the colony forming efficiency of HL-60 cells in semisolid agar culture. Conclusions: Above results suggest that methanol extract of Hedyotis diffusa induces the apoptotic death of human leukemic HL-60 cells via activations of Caspase-3 proteases, JNKI, transcriptional activator $NF-{\kappa}B$, In addition, our results also suggest that methanol extract of Hedyotis diffusa reduces the malignant potential of HL-60 cells via down regulation of colony forming effciency through cleavage of Bc12 as well as induction of Bax.

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Demecolcine 처리에 의한 탈핵과 수핵란 세포질의 세포 주기가 소 핵이식란의 발육에 미치는 영향 (Effect of Demecolcine-Assisted Enucleation and Recipient Cell Cycle Stage on the Development of Nuclear Transfer Bovine Embryos)

  • 백진주;박춘근;양부근;김정익;정희태
    • Reproductive and Developmental Biology
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    • 제29권3호
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    • pp.175-180
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    • 2005
  • 본 연구는 demecolcine 처리에 의한 탈핵과 수핵란 세포질의 세포 주기가 소 체세포 핵이식란의 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 체외에서 $16\~20$시간 성숙배양된 난자를 극체 방출 유무 및 MI, MII기 난자로 구분하여 $0.4\;\muL/mL$ demecolcine으로 40분간 처리 후 염색체 부위가 돌출된 난자는 탈핵 후 핵이식에 공시하였다. 소의 귀 피부 세포를 탈핵란에 이식하여 전기융합과 활성화 처리(Ca-ionophore+DMAP)를 거쳐 체외 배양하였다. Demecolcine처리 후 $86.2\%$의 난자가 염색체 부위의 돌출을 보여 이 중 $98.8\%$가 탈핵에 성공하였다. Demecolcine은 핵이식란의 발육에 영향을 주지 않았다. 제1극체 방출란 유래 핵이식란의 배반포 발육율은 극체 미방출란 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 높았다($18.2\%\;vs.\;4.6\%\cdot$, P<0.05). 한편, MI 난자 유래 핵이식란의 분할율 및 배반포 발육율은($69.4\%$$5.9\%$) MII 난자 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 낮았다($96.7\%$$23.9\%$, P<0.05). 본 연구의 결과는 demecolcine 처리가 소 난자의 탈핵에 매우 효과적이며 MII기 난자가 MI기 난자에 비하여 수핵란 세포질로 더 적절하나 극체 미방출란 및 MI기 난자도 비록 제한적이기는 하지만 핵이식란의 배반포 발육을 지원할 수 있음을 보여준다.

미국 북서 네바다주 험볼트 산맥의 구조분석 (Structural characteristics of Humboldt Range, northwest Nevada, U. S. A.)

  • 정상원
    • 암석학회지
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    • 제8권3호
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    • pp.131-148
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    • 1999
  • 미국 네바다주 북서지역은 주요 구조층서적 지구대의 상대적 이동에서 특징적이며 복잡한 구조가 발달되었다. 본 연구지역은 삼첩기 초기의 코이파토 층군과 삼첩기 중기의 스타피크 층군의 현지성 암석으로 구성되며, 이들 현지성 암석은 미국 네바다 북서지역의 험볼트 산맥에 위치한다. 본 연구는 쥬라기에서 백악기 말기동안 작용한 변형작용의 역사 그리고 그와 관련된 조직의 발달 그리고 고응력상태의 분석에 역적을 두었다. 펜스메이커 타지성 암석은 험볼트 산맥의 현지성 암석위로 E에서 ESE 방향으로 오우버 드러스트함에 따라 현지성 암석에 다변형작용을 보여둔다. 이러한 중생대 전지 변형자?에 관련된 구조는 N나 NNE 방향으로 잘 발달된 엽리구조, 서로 다른 습곡형태, 소규모의 드러스트, 전위 엽리의 발달 그리고 강력한 압쇄작용을 들 수 있다. 이들 구조는 험볼트 산맥의 서쪽 경계부를 따라 발달되었으며 미국 북서 네바다 지역에서의 최초 전지 변형작용 알려져 있다. 광역주 압축응력(${\sigma}_1$)은 여러 가지 $D_1$ 구조의 방향에 근거하여 E나 ESE 방향으로 밝혀졌다. 백악기 중기와 말기의 변형작용은 일정하게 배열된 N나 NNE 방향으로 주향하는 변성 석영맥과 기존에 발달된 $D_1$ 엽리구조에 평형한 전단대를 들 수 있다. 변성 석영맥의 일정한 방향성과 이와 관련된 구조는 백악기 중기와 말기의 본 연구 지역에 가해진 광역 주 응력 방향으로 해석되었다. 전단대의 전단감각은 우수 전단 방향으로서 이전에 형성된 $D_1$ 구조의 재활동에 근거한다. 이러한 결과는 쥬라기로부터 백악기 말기까지 연구지역에 작용한 광역 주 응력이 시계 반대방향으로 회전되었음을 반영한다. 마지막으로, 전단띠 벽개와 S/C 압쇄조직의 발달은 연구지역에서의 전단대가 불균질 단순 전단 작용을 받았음을 나타내며 또한 압쇄암 형성시 단축 작용동안 비동축류의 지대로서 작용했음을 나타낸다.

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지금초 추출물에 의한 TRAIL 저항성 인체위암세포의 세포사멸 유도 (Euphorbiae Immifusae Sensitizes Apoptosis of TRAIL-resistant Human Gastric Adenocarcinoma AGS Cells)

  • 이재준;신동역;박상은;김원일;박동일;최영현;홍상훈
    • 생명과학회지
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    • 제18권1호
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    • pp.120-128
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    • 2008
  • 본 연구에서는 지금초 열수 추출물(WEEH)의 처리에 의한 TRAIL 저항성 인체 위암세포의 증식 억제와 연관된 apoptosis유발에 관한 기전 해석을 시도하였다. 이를 위하여 AGS 세포주가 사용되었으며 다음과 같은 결과를 얻었다. 본 연구에서 조사된 범위 내에서의 TRAIL (200 ng/ml) 및 WEEH (0.04 mg/ml)의 단독 처리에 의한 AGS 세포에 유의적인 세포 독성을 나타내지 않았다. 그러나 TRAIL 및 WEEH의 혼합 처리는 WEEH의 처리 농도의존적으로 AGS 세포의 증식을 억제하였으며, 이는 apoptosis 유발에 의한 것임을 MTT assay, 핵의 염색질 응축 및 세포주기 sub-G1기에 속하는 세포빈도의 증가 등으로 확인하였다. TRAIL 및 WEEH 혼합 처리에 의한 apoptosis 유발 기전의 해석을 위하여 다양한 생화학적 분석법에 의하여 조사된 결과에 의하면, TRAIL 및 WEEH 혼합처리에 의한 caspase-8의 활성화에 의한 BID의 truncation화 및 이와 연관된 미토콘드리아 기능의 손상에 따른 caspase-9의 활성화와 연관성이 있었다. 이러한 미토콘드리아 기능 손상 및 caspase-9의 활성화는 Bcl-2, Bcl-xL, XIAP 및 cIAP-2등과 같은 anti-apoptotic 인자들의 발현 저하와 연관성이 있는 것이며, 이로 인한 caspase-3의 활성화에 의한 PARP 단백질의 단편화 유도로 apoptosis가 일어난 것으로 예측되어 진다. 비록 부가적인 연구들이 요구되어지지만, 본 연구의 결과는 TRAIL저항성 암세포의 항암전략에 지금초 추출물의 적용 가능성을 보여주는 것으로서 지금초의 항암작용의 규명에 중요한 자료를 제공하여 줄 것으로 생각된다.

배양액 및 산소농도가 돼지 체외수정란의 발달에 미치는 영향 (Effects of Culture Media and Oxygen Concentration on In Vitro Development of Porcine IVM/IVE Embryos)

  • 최창용;조상래;최선호;김현종;한만희;강다원;신용원;한재희;손동수
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제22권3호
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    • pp.155-160
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    • 2007
  • 본 연구는 돼지 체외수정란 생산효율을 향상시켜 돼지의 품종개량, 형질전환 돼지생산 등과 멸실위험에 처해 있는 유전자원의 보존을 위한 기술로 활용하기 위해 미성숙 난포란의 적정 체외성숙 시간을 알아보고, 배양액의 종류 및 체외 배양시의 산소 농도에 따른 체외수정란의 생산 효율을 확인한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간별 제2감수분열중기(M II)까지 성숙된 비율이 체외성숙 38, 40, 42시간째에 각각 61.1%, 42.9% 및 69.6%를 나타내어 그 비율이 70% 미만으로 낮은 반면, 체외성숙 44, 46, 48시간째에 각각 73.7%, 94.1% 및 100%의 체외성숙률을 나타내어 최소한 44시간 이상의 체외성숙이 필요한 것으로 조사되었다. 2. 체외배양액의 종류에 따른 배반포 발달률이 NCSU-23 18.8%, PZM-5 16.3%를 나타내어 유의적인 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 산소분압에 따른 배반포 발달률이 5% 산소분압에서 11.9%, 20%의 산소분압에서 15.8%를 나타내어 두 군간의 유의한 차이는 보이지 않았다(p>0.05). 3. 체외배양 7일째 발달된 배반포 수정란의 총세포수는 40개 내 외를 나타내었다. 이상의 결과, 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간은 44시간 정도가 적정한 것으로 확인되었으며, 서로 다른 배양액과 산소농도가 돼지 체외수정란의 배발달에 있어서 유의적인 차이를 나타내지는 못하였다.

멸균 방법에 따른 교정용 플라이어의 물성 변화에 대한 비교 연구 (A COMPARATIVE STUDY ON THE PHYSICAL PROPERTIES OF ORTHODONTIC PLIERS ACCORDING TO TYPES OF STERILIZATION)

  • 조일제;손우성
    • 대한치과교정학회지
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    • 제28권2호
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    • pp.329-341
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    • 1998
  • 간염이나 AIDS의 영향으로 멸균에 대한 관심이 높아지고 있으며, 교정 진료실에서도 교정용 플라이어의 멸균이 필요하게 되었다. 제조회사에서는 멸균 과정의 열이 교정용 플라이어에서의 야금학적 변화를 야기하지 않는다고 하지만 교정치과의사들은 가압 증기 멸균기나 대류식 건열 멸균기를 이용하여 반복적으로 멸균을 시행한 경우에 ligature cutter의 날이 쉽게 무디어져서 ligature cutter의 수명이 짧아진다는 것을 임상적 경험으로 알고 있다. 본 연구는 멸균과정이 교정용 플라이어의 물성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시행되었다. 본 연구에 사용된 교정용 플라이어는 멸균 과정을 견딜 수 있도록 개발했다고 주장하는 AEZ, Unitek과 Dentronix ligature cutter이었고, 멸균기는 대류식 건열 멸균기인 Bowmar RHT-1000과 Dentronix DDS-5000와 가압 증기 멸균기 인 Eschmann SES-2000이었다. 멸균하기 전과 200회와 400회 멸균한 후의 ligature cutter의 날 부위의 표면과 파단면의 상태는 주사 저자 현미경으로, 미세 조직은 광학 현미경으로 관찰하고, micro-Vickers와 Rockwell 경도 시험기로 경도를 측정하고, SEM-EDX로 조성 분석을 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 주사 전자 현미경을 이용한 교정용 플라이어의 날 부위의 표면과 파단면의 관찰에 의하면 멸균 횟수의 증가에 따라서 표면 조직에서 검은 반점 형태의 부식 생성물의 수와 크기가 증가하는 경향이 있었으며 파단면의 관찰에서도 멸균 횟수의 증가에 따라서 전형적인 취성 파면인 벽개면의 분포율이 증가하는 경향이 있었다. 이러한 부식 현상과 금속 조직의 취성화로 기계적 특성이 저하될 것으로 사료되었다. 2. 광학 현미경을 이용한 미세 조직 사진의 관찰에서도 멸균 횟수의 증가에 따라서 Cr계 탄화물의 수와 크기가 증가하는 경향이 있었다. 이러한 금속 조직의 조대화에 따라서 기계적 특성이 저하된 것으로 생각되었다. 3. 교정용 플라이어의 날 부위의 경도는 멸균 횟수의 증가에 따라서 감소되었는데 경도의 감소는 멸균에 의한 부식생성물과 표면 조직의 변화에 따른 것으로 생각되었다. 4. SEM-EDX를 이용한 조성 분석의 결과에 의하면 AEZ과 Unitek ligature cutter는 Fe-Cr계 stainless steel이었고, Dentronix ligature cutter는 Co-Cr계 합금이었는데, 제조 회사에 따라서 금속의 조성은 달랐지만 멸균 전후의 비교에서는 큰 차이가 없었다. 5. 반복적으로 멸균을 하면서 실제 임상에서 사용한 교정용 플라이어의 날의 표면 조직을 주사 전자 현미경으로 관찰한 결과, 미세 균열을 발견할 수 있었다.

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hFSH 유전자가 도입된 소 태아섬유아세포를 이용한 형질 전환 복제 수정란의 발달 (Development of Transgenic NT Embryos Using Bovine Fetal Fibroblasts Transfected with hFSH Gene)

  • 양병철;임기순;김동훈;민관식;윤두학;박효숙;김세웅;황인선;서진성;성환후;양보석
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제21권1호
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    • pp.13-20
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    • 2006
  • 본 연구의 목적은 요를 통해 hFSH를 발현하는 형질 전환 소의 생산이다. 요의 분비와 관련 있는 유전자로서 mUII promoter를 사용하여 hFSH유전자를 구성했다. 태아섬유아세포(KbFF)는 임신 45일령의 태아(male)에서 채취하였다. hFSH gene은 pcDNA3(neo) vector와 같이 KbFF 세포에 electroporation 방법으로 transfection하였다. 유전자를 transfection한 세포는 G-418로 2주 동안 배양하였고, 선발된 colony는 PCR로 확인하였다. 핵이 제거된 난자는 hFSH가 transfection된 세포와 transfection 되지 않은(control) 세포를 이용하여 핵이식하였다. 48시 간 후 hFSH가 transfection된 세포는 68.7%의 수정란이 난할되었으며, 8일 후 15.7%의 수정란이 배반포로 발달하였다. 그러나 대조구에서는 67.6%가 난할되었으며, 24.5%가 배반포로 각각 발달하였다. 이들 배반포에서 apoptosis 분석 결과 hFSH 유전자가 transfection된 또는 transfection되지 않은 대조구에서 유의적인 차이는 보이지 않았다. 배반포는 53두의 수란우에 이식하여 두 마리의 산자가 생산되었으나(1.9%) hFSH가 transfection되지 않은 것으로 나타났다. 이 결과는 선발된 hFSH colony에서 transfection되지 않은 세포가 혼합되어 있었다는 것을 나타내 주고 있으며, colony의 선발과 검증에 더 많은 연구의 필요성이 있음을 나타내준다.

공핵 세포 및 발정 동기화가 복제 재래 산양 생산에 미치는 영향 (Effects of Donor Cells and Estrus Synchronization on the Production of Cloned Korean Native Goat)

  • 박희성;김태숙;정수영;박준규;이지삼;정장용
    • 한국수정란이식학회지
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    • 제21권2호
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    • pp.137-146
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    • 2006
  • 본 연구는 공여 세포의 종류, 수핵 난자의 유래 및 수란 산양 발정 동기화 조건이 복제 산양 생산에 미치는 영향을 알아보고자 실시되었다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하였으며, 배란이 되지 않은 난포란은 난포로부터 흡입 채취한 후, 22시간 동안 체외 성숙을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 zona drilling 후, 극체와 세포질 일부분 제거를 통해 제핵을 실시하고, 핵이 제거된 난자의 위란강 내로 공핵 세포를 도입하여 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기 자극 방법으로 실시되었으며, 융합이 완료된 핵이식란의 활성화처리는 핵이식 3시간 후에 Ionomycin과 6-DMAP를 병용 처리하여 실시하였다. 복제 수정란의 체외배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 $2{\sim}4$ 세포기까지 체외 배양을 실시한 다음 수란 산양의 난관에 외과적으로 이식하였다. 임신 진단은 초음파 임신 진단기로 이식 후 제 30일과 60일에 실시하였다. 귀세포를 공핵 세포로 사용하였을 때 융합율이(63.8 VS. 26.5%) 태아 세포를 사용했을 때보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 총 102개의 복제 수정란을 20두에 이식하였으며, 30일에 4두(20.0%)가 임신하였으며 이중 1두가 1두의 복제 산양을 생산하였다. 수란 산양과 공란 산양간의 발정 동기화 간격(${\pm}0$ 또는 +12시간)별 수태율은 각각 18.2 및 16.7%로서 유의적인 차이가 없었다. 수란 산양의 발정 유기 방법에 따른 수태율에 있어서 CIDR 제거 후 hCG 및 PMSG를 투여하였을 때는 25%가 수태하였으나, hCG만 투여한 수란 산양은 수태가 되지 않아 인위적으로 발정 동기화된 수란 산양을 이용하였을 때는 산자를 생산하지 못했다. 자연 발정 산양의 경우, 발정이 동기화된(${\pm}0$) 수란 산양 1두에 체내 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산한 5 개의 복제 수정란을 이식하여 149일만에 국내에서 처음으로 복제 산양(진순이) 생산에 성공하였다. 체외 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산된 복제 수정란 5개를 이식하였으나 수태가 이루어지지 않았다. 이상의 결과로 볼 때 재래 산양의 체세포 핵이 식에 의한 복제 산자 생산에서 보다 효율성을 높이고 수태율을 향상시키기 위한 조건은 체내 성숙 난자를 수핵 난자로 이용하여 공란 산양과 발정이 동기화된(${\pm}0$) 자연 발정 수란 산양에 복제 수정란을 이식하는 것이 바람직한 것으로 생각된다.