알긴산을 분해하기 위하여 갈조류로부터 분해활성이 있는 해양미생물을 분리하였다. 분리된 균주의 16S ribosomal DNA를 분석한 결과 이전에 보고했던 ALG-5 균주와 비슷한 Streptomyces sp.에 속하는 것으로 나타났다. 상동성이 있는 염기서열로 고안한 특이적인 primer로 PCR을 행함로서 Streptomyces sp. M3의 새로운 alginate lyase 유전자를 클로닝하였다. M3 alginate lyase의 예상 아미노산 서열에는 N-terminal 영역에 YXRSELREM 서열과 C-terimnal 영역에 YFKAGXYXQ 서열이 보존되어 있었다. M3 alginate lyase 단백질의 homology model은 Corynebacterium sp. ALY-1으로부터 얻은 단백질인 alyPG와 같이 $\beta$-jelly roll fold를 main domain으로 가지고 있음이 나타났다. M3 alginate lyase 유전자를 가지는 재조합 E. coli의 세포균질액은 polymannuronate block보다는 polyguluronate block에 대하여 높은 분해력을 가지고 있었다. 아미노산 서열 다중정열 및 homology modeling으로부터 얻은 결과는 M3 alginate lyase가 Family PL-7으로 분류될 수 있음을 말해 준다.
해운대 연안에서 그람 음성균이면서 알긴산 분해효소를 생산하는 세균을 분리하였다. 분리된 N7151-6 균주의 성장을 위한 최적 온도는 $30^{\circ}C$, 최적 pH는 8.0으로 조사되었다. 또한 0-7%(w/v) NaCl 농도에서도 성장 가능하다. 16S rDNA 염기 서열 분석과 생화학적 분석에 의해 이 균주는 Pseudomonas 속으로 동정되어 Pseudomonas sp. N7151-6으로 명명하였다. Pseudomonas sp. N7151-6에서 생산하는 알긴산 분해효소를 한외여과(ultrafilteration; MWCO=30 kDa) 방법에 의해 부분정제하였다. 분리된 효소의 최적 pH는 7.0으로 최적 온도는 $30^{\circ}C$로 조사 되었다. pH 5.0에서 9.0까지 이 효소는 안정하였으며, $23^{\circ}C$에서 $37^{\circ}C$까지의 범위에서도 안정성을 보여주었다. 알긴산 분해효소의 전체 활성은 110 unit/L이었다.
Malonate kinase and isocitrate lyase were induced in Acinetobacter calcoaceticus grown on malonate as a sole carbon source but repressed by succinate. The induction of those two enzymes was stimulated by dibutyryl cyclic adenosine 3', 5'-monophosphate, indicating that the expression of their genes for those enzymes is dependent on cyclic adenosine 3', 5'-monophosphate.
In a previous study, we isolated and reported a second species of the Saccharophagus genus, Saccharophagus sp. strain Myt-1. In the present study, an alginate lyase gene (algMytC) from the genomic DNA of Myt-1 was cloned and characterized. The DNA sequence fragment obtained contained an open reading frame of 1,032 bp that encoded a protein of 343 amino acids with an estimated molecular mass of 37.6 kDa and a pI of 6.60. The deduced protein, AlgMytC, had the conserved amino acid sequences (RTELREM, QIH, YFKAGVYNQ) of the polysaccharide lyase family 7. A BLAST homology search indicated that AlgMytC shared an amino acid sequence identity of 95.9% with alg7A of S. degradans 2-40. The cloned and purified AlgMytC protein showed optimal activity at $40^{\circ}C$, and retained more than 90% of its total activity even after treatment at $25^{\circ}C$ for 24 h. AlgMytC was very alkaliphilic with an optimal pH of 9.0, and more than 90% of its activity was retained in the pH range 8.5-10.0. Moreover, AlgMytC was stable over a wide pH range. The activity of AlgMytC was also stable in the presence of various detergents.
The research was purposed production of oligosaccharide from alginate hydrolysis the main composition in cell walls of sea weed. We was isolated 252 strains from sea water and mud flat, the highest alginate lyase activity was selected, and identified as Sanguibacter keddieii NC9 by 16S rDNA sequence analysis. In this study was select the sodium alginate concentration, pH, temperature for the production of alginate lyase activity. Alginate lyase activity was confirmed from plate assay with 10% cetylpyridinium chloride. The optimum culture conditions for the production of alginate lyase were sodium alginate 10 g/L, peptone 5 g/L, $40^{\circ}C$, pH 9 and 36 hours incubation time. Sanguibacter keddieii NC9, its alginate lyase would be useful for the production of bioenergy and biofunctional oligosaccharides from sea weed.
Micrococcus luteus 가 생산하는 isocitrate lyase 의 효소단백질을 ammonium sulfate precipitation, DEAE-cellulose, DEAE-sephacel, 1차 Sephadex G-200, 2 차 Sephadex G-200 column chromatography 과정을 통하여 분리 정제하였으며 정제된 효소의 분자량과 효소학적 특성을 조사하였다. 정제된 isocitrate lyase 는 상기 정제 과정을 통하여 10.2%의 회수율과 38.8 의 정제도를 나타내었으며, 전기영동시 단일밴드를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE 에 의해 측정된 분자량을 약 60,000이며 1개의 subunit 로 나타났다. 본 효소의 최적 pH 는 7.5이었으며, 최적 온도는 $40^{\circ}C$ 부근이었고 $45^{\circ}C$까지는 안정하였다. 2가 금속염의 첨가시$ Mg^{2+}$ 를 제외한 다른 금속이온들은 효소활성을 저해하는 것으로 나타났으며 $Mg^{2+}$의 농도는 5 mM 에서 최대활성을 나타내었다. 또한 기질인 DL-isocitrate 의 $K_{m}$ 치는 0.95 mM 로 나타났으며, thiol 화합물의 첨가시 cysteine 은 1mM, glutathione과 $\beta$-mercaptoethanol 은 5 mM 의 농도에서 효소활성이 최대에 달하였다.
알긴산 올리고당은 생체에 다양한 생리활성효과를 나타내는 기능성 식품의 소재나 고부가가치 재료로서 활용 가능성이 높아 여러 응용 범위 내에서 사용될 수 있다. 알긴산은 해조류의 주요 구성성분으로 주로 갈조류에 많이 존재한다. 해조류로부터 다양하게 활용이 가능한 알긴산 올리고당을 제조하기 위해 Erwinia tasmaniensis 균주가 생성하는 효소를 이용하여 알긴산을 효소적으로 분해하고자 하였다. 따라서 본 연구에서는 E. tasmaniensis의 최적 배양조건과 균주가 생성해내는 알긴산 분해 효소의 성질 및 특성을 알아보았다. 실험 결과, 이 균주의 최적 배양을 위한 배지 내 알긴산의 최적 농도는 1.0%, 최적 시간은 36 h이었으며, 알긴산 분해 효소의 활성은 알긴산이 1.0% 포함된 배지에서 72 h동안 배양했을 때 가장 높았다. 이 효소의 최적 pH는 6.0, 최적 온도는 $20^{\circ}C$로 확인되었다. 또한 효소의 활성은 $20^{\circ}C$에서 60 min까지 지속됨을 확인했다.
Rhodotorula glutinis IFO 0559에서 유래하는 L-phenylalanine ammonia lyase(EC 4. 3. 1. 5)를 이용하거나, 유도된 세포자체를 이용하여 trans-cinnamic acid로부터 L-phenylalanine을 생합성할 때 극단적인 반응액이 미치는 효소 및 세포의 안정성에 대하여 조사하였다. 그리고 안정제를 첨가한 60%의 glycerol은 효소의 안정화에 효과를 보였으며 trans-cinnamic acid에서 L-phenylalanine으로의 전이율은 80%까지 되었다. 이에 아울러 전이율을 보다 신속하고 정확히 측정할 수 있는 wavelength scanning 방법을 개발하였다.
스테로이드 합성효소 중 $17\;{\alpha}-hydroxylase/17,20-lyase(P450_{C17})$는 progesterone을 $17\;{\alpha}-hydroxyprogesterone$을 거쳐 androstenedione으로 변환을 담당하는 효소이다. 양서류 난소에서 스테로이드 합성의 분자적 조절과정의 연구에 사용할 목적으로 북방산 개구리(Rana dybowskii) 난소에서 $P450_{C17}$ cDNA를 클로닝 하였다. 북방산 개구리 난포세포의 cDNA library 검색을 통해 분리된 약 2.5kb의 cDNA는 529개의 아미노산을 가진 단일 번역틀을 가지고 있었다. 개구리 $P450_{C17}$의 아미노산 서열은 Xenopus와는 76%, 닭과는 63%, 그리고 사람과는 약 45%의 동일성을 보여 주였고, 동시에 진화적으로 척추동물에서 매우 잘 보존된 아미노산 서열을 가지고 있었다. 노던 분석에서 개구리의 $P450_{C17}$ 전사체는 난소에서만 2.5kb와 3.6kb 크기의 두 종류가 발견되었다. 그리고 개구리 Rana $P450_{C17}$ cDNA는 비스테로이드 합성 세포인 COS-1세포에서 분명한 $17\;{\alpha}-hydroxylase/17,20-lyase$ 활성을 주었다. 따라서 클로닝된 개구리 $P450_{C17}$ 유전자는 양서류의 난소에서 스테로이드 합성의 분자적 기작을 연구하는데 매우 유용할 것으로 사료된다.
알긴산분해효소(EC 4. 2. 2. 3)를 균체외로 생산하는 새로운 방선균을 전라남도 완도의 연안토양으로부터 분리하고 이 균주를 Streptomyces sp. MET 0515라 명명하였다. 이 균주가 생산하는 균체외 알긴산분해효소를 아세톤 침전, 음이온 교환 크로마토그래피(Q-Sepharose and DEAE-Sepharose), 젤 크로마토그래피(Sephacryl S-200 HR gel filtration chromatography)를 이용하여 정제하였다. 이 효소의 최적 활성 온도과 pH는 각각 $70^{\circ}C$와 pH 7.5이고, 온도 안정성은 $0-50^{\circ}C$, pH 안정성은 pH 6.0-9.0였다. 이 효소는 $Mn^{2+}$ 이온 첨가시에는 활성이 증가하였으며 1mM $Fe^{3+}$, 1mM EDTA, 1mM $Zn^{2+}$ 이온 첨가시에는 활성이 억제되었다. 또한 이 효소는 poly-alpha 1,4-L-guluronate와 poly-beta 1,4-D-mannuronate두 종류의 기질에 대하여 활성을 나타냈다. 따라서 본 효소는 다른 미생물 기원의 효소와 비교해 볼 때 Streptomyces sp.가 생산하는 첫번째 효소로 인정되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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