• 한국가축번식학회지
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• 제27권1호
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• pp.25-34
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• 2003

인체 트롬보포이에틴(hTPO)은 megakaryopoiesis 과정에 주요한 역할을 하는 사이토카인이다. 따라서 이러한 트롬보포이에틴을 유선조직에서 직접적으로 발현시키기 위하여 소 베타 카제인 프로모터, 인체 트롬보포이에틴 cDNA 및 네오유전자로 구성된 발현벡터를 구축하였다. 소 귀조직 세포로부터 유도된 섬유아세포에 lipoffctamine을 이용하여 발현벡터(pBT-L n대)의 삽입을 유도하였다. G4l8 저항성을 지닌 세포의 콜로니 형성을 유도하기 위하여 2주 이상 배양을 실시하였다. 형질전환 콜로니는 PCR에 의해 동정하였으며, 이들 콜로니를 핵치환 전까지 계속적으로 증식을 유도하였다. 형질전환 세포에 의해 재구성된 난자는 전기적인 융합과 calcium ionophore와 6-DMAP를 이용한 활성화를 실시하였으며, 체외에서 7일간 배양을 실시하였다. 총 35개의 콜로니를 PCR에 의해 분석한 결과, 이 중 29(82.9%)개가 형질전환된 콜로니였다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자의 난할율 및 배반포로의 발달율은 65.1%와 23.8%로 나타났다. 형질전환된 세포로 재구성된 난자로부터 발달한 29개의 배반포 중 27개가 형질전환으로 확인되었다. 따라서 이러한 결과들은 형질전환 소 수정란을 형질전환된 세포를 이용한 체세포 복제 기법을 통해 효과적으로 생산할 수 있다는 것을 제시하고있다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권3호
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• pp.235-243
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• 2002

본 연구는 몇 몇 포유류로부터 얻은 공여세포핵의 proliferation을 돕기 위한 수핵난자로 소 난자의 세포질을 사용하였으며, 공통 세포질로써의 능력을 시험하였다. 소 난자와 소, 사람, 돼지, 생쥐의 체세포와의 결합에서 유래한 각 종별 핵이식란의 융합율, 분할율, 배발달률 그리고 염색체 수를 조사하였다. 1. 소, 돼지, 생쥐, 사람 각각의 체세포를 이용한 핵이식란의 융합율은 70.2% 70.2% 72.4%와 63.0 %로 유의차를 보이지 않았다. 2. 소, 돼지, 생쥐, 사람 각각의 체세포를 이용한 핵이식란의 체외분할 ($\geq$2cell cleavage)율 또한 60.6%, 63.7%, 54.1%와 62.7%로 유의차가 없었다. 3. 각 종별로 체외분할이 일어난 시기를 조사한 결과 종에 관계없이 대체로 활성화 처리 후 24시간째에 대부분 일어나는 것을 볼 수 있었다. 그러나 점차적으로 분할이 계속 이루어지면서 발달시기가 종 특이적인 특성을 나타내는 것을 볼 수 있었다. 4. 이종간 핵이식의 후기 배발달 (상실배와 배반포) 률을 살펴보면 소와 사람의 체세포를 사용했을 경우 17.5%, 4.3%의 결과를 나타내었으며, 돼지와 생쥐의 체세포를 사용한 경우 16세 포기 이후 단계에 발달중지 현상을 볼 수 있었다. 5. 4~8 세포기 정도의 각 종별 핵이식란 할구를 분석에 사용하였을 때, 공여핵으로 사용된 종의 염색체 수와 일치하는 결과를 볼 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 성숙한 소 난자의 세포질은 소뿐만 아니라 돼지, 생쥐, 사람과 같은 다양한 포유류의 핵을 사용하여 핵이식을 하였을 때에도 발달이 가능하다는 것을 보여주고 있다.

• International Journal of Oral Biology
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• 제39권4호
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• pp.177-185
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• 2014

Transfection is a gene delivery tool that is a popular means of manipulating cellular properties, such as induced pluripotent stem cell (iPSC) generation by reprogramming factors (Yamanaka factors). However, the efficiency of transfection needs to be improved. In the present study, three transfection protocols - non-liposomal transfection (NLT), magnetofection and electroporation - were compared by analysis of their transfection efficiencies and cell viabilities using human dental pulp cells (hDPC) and bovine fetal fibroblasts (bFF) as cell sources. Enhanced green fluorescent protein gene was used as the delivery indicator. For magnetofection, Polymag reagent was administrated. NLT, FuGENE-HD and X-treme GENE 9 DNA transfection reagents were used for NLT. For electroporation, the $Neon^{TM}$ and $NEPA21^{TM}$ electroporators were tested. $Neon^{TM}$ electroporation showed highest transfection efficiency when compared with NLT, magnetofection, and $NEPA21^{TM}$ electroporation, with transfection efficiency of about 33% in hDPC and 50% in bFF, based on viable cell population in each cell type. These results suggest that transfection by $Neon^{TM}$ electroporation can be used to deliver foreign genes efficiently in human and bovine somatic cells.

• 한국수정란이식학회지
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• 제30권3호
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• pp.229-237
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• 2015

To improve the developmental potential of bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos, this study compared the developmental rates to blastocyst stage in the SCNT embryos using donor fibroblasts treated with 5-azacytidine (5AC) and S-adenosylhomocysteine (SAH) at different concentrations. Their reprogramming efficiency level was investigated with level of telomerase activity. Donor fibroblasts isolated from adult ear skin of a cow were exposed to 5AC and SAH at different concentrations during 2 passages. After nuclear transfer into enucleated recipient oocytes, the cleavage and developmental rates were significantly (p<0.05) decreased in the SCNT embryos using 5AC-treated fibroblasts (5AC-SCNT embryos), compared with those of non-treated control (control-SCNT embryos) and SAH-treated fibroblasts (SAH-SCNT embryos). The developmental rates to blastocyst stage tended to be slightly increased in the SAH-SCNT embryos at each of the concentrations, and especially, the developmental rates in the SCNT embryos using 1.0 mM SAH-treated fibroblasts were significantly (p<0.05) higher than that of control SCNT embryos. The mean numbers of total and ICM cell in blastocysts were also significantly (p<0.05) decreased in the 5AC-SCNT embryos, compared with those of other SCNT blastocysts. Further, the level of telomerase activity was also significantly (p<0.05) decreased in the 5AC-SCNT embryos than those of control and SAH-SCNT embryos. Whereas, a significantly (p<0.05) up-regulated telomerase activity was observed in SAH-SCNT embryos, compare with that of control-SCNT embryos. In conclusion, SCNT embryos using hypomethylated donor cells with SAH, not 5AC, may improve the developmental potential and reprogramming efficiency.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제38권2호
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• pp.71-77
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• 2014

The specific genetic modification in porcine somatic cells by gene targeting has been very difficult because of low efficiency of homologous recombination. To improve gene targeting, we designed three kinds of knock-out vectors with ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase gene (${\alpha}1,3$-GT gene), DT-A/pGT5'/neo/pGT3', DT-A/NLS/pGT5'/neo/pGT3' and pGT5'/neo/ pGT3'/NLS. The knock-out vectors consisted of a 4.8-kb fragment as the 5' recombination arm (pGT5') and a 1.9-kb fragment as the 3' recombination arm (pGT3'). We used the neomycin resistance gene (neo) as a positive selectable marker and the diphtheria toxin A (DT-A) gene as a negative selectable marker. These vectors have a neo gene insertion in exon 9 for inactivation of ${\alpha}1,3$-GT locus. DT-A/pGT5'/neo/pGT3' vector contain only positive-negative selection marker with conventional targeting vector. DT-A/NLS/pGT5'/neo/pGT3' vector contain positive-negative selection marker and NLS sequences in upstream of 5' recombination arm which enhances nuclear transport of foreign DNA into bovine somatic cells. pGT5'/neo/pGT3'/NLS vector contain only positive selection marker and NLS sequence in downstream of 3' recombination arm, not contain negative selectable marker. For transfection, linearzed vectors were introduced into porcine ear fibroblasts by electroporation. After 48 hours, the transfected cells were selected with $300{\mu}g/ml$ G418 during 12 day. The G418-resistant colonies were picked, of which 5 colonies were positive for ${\alpha}1,3$-GT gene disruption in 3' PCR and southern blot screening. Three knock-out somatic cells were obtained from DT-A/NLS/ pGT5'/neo/pGT3' knock-out vector. Thus, these data indicate that gene targeting vector using nuclear localization signal and negative selection marker improve targeting efficiency in porcine somatic cells.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권4호
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• pp.407-417
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• 2000

본 연구는 태아 섬유아세포를 이용한 소 핵치환 난자의 융합에 있어서 여러 조건의 전기자극 처리 후 그에 따른 발달율을 조사하였다. 임선 45 일령 태아로부터 섬유아세포를 분리하여 3~4 차례 계대배양후, 이들 단일 섬유아 세포들을 미세조작기를 이용하여 제핵된 난자의 위란강 내에 주입하였다. 본 실험에서는 첫째로, 다른 전기자극 조건의 적용에 따른 융합율 및 발달율을 비교 조사하였다. 180 V/mm 의 조건하에서 다른 조건의 전기자극 시간 (15, 30, 45 $\mu$see)을 처리하였을 때, 15 (45.5%, 120/264)나 30 $\mu$see (43.9%, 106/241) 처리구가 45$\mu$see (23.2%, 58/250) 처리구 보다 높은 융합율을 나타내었다 (P＞0.05). 그러나, 융합된 난자의 발달율에 있어서는 처리구 간에 차이가 나타나지 않았다. 다음 실험으로, 핵치환 난자의 체외발달에 있어서 15 $\mu$see 의 전기자극 시간의 조건하에서 다른 전장 (1.5, 1.8, 2.1 kV/cm)에 따른 효과를 조사하였다. 핵치환 난자의 융합이나 발달율에 전장에 따른 차이는 나타나지 않았다 (P＞0.05). 마지막으로, 체세포 핵치환과 체외수정에 의한 수정란의 체외 발달율을 비교 조사하였다. 태아 섬유아세포로 재구성된 수정란의 배반포로의 발달율은 27.4% (75/274) 로 나타났으며, 이는 체외수정에 의해 발달한 배반포의 비율(24.5%, 58/237)과 유사하다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 핵치환에 의해 유도된 배반포의 평균 세포 수는 체외수정에 의해 유도된 배반포 보다 낮게 나타났다. 결론적으로, 본 실험에서는 체세포로 핵치환된 소 난자의 전기적 융합에 대한 조건 (1.8 kV/cm, 15 $\mu$see)을 확립하였다. 또한, 본 실험에서 나타난 결과들은 체세포로 재구성된 소 난자들이 비록 체외수정에 의해 생산된 배반포보다는 적은 세포수를 보여주었지만, 체외에서 정상적으로 배반포 단계까지 발달할 수 있다는 것을 제시하고 있다.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.109-109
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• 2003

Even though success in birth of live offspring from nuclear transfer(NT) using somatic cells in many species, detailed information on processes or mechanisms of development are not well known. Cytoplasm of bovine oocyte has been known to support the development of nuclear transferred embryos using nuclear donor cells from different species. Therefore, interspecies NT might be used to find answers of some questions in basic aspect of nuclear transfer In this study, we examined the developmental potential of reconstructed embryos when bovine oocyte as a cytoplasm recipient and mouse embryonic fibroblast as a nuclear donor were used. The nuclear transfer units were aliocated in Group 1 (murine block media and normal media) and Group 2. (bovine block media and normal media). NT units were not blocked at 2-cell stage regardless of types of medium. On mouse media, poor development of interspecies NT units was observed compared to bovine media. However, as NT units cultured in bovine normal medium, embryos developed over 8-cell stage. Further studies performed to increase the developmental rate in condition of antioxidant treatment. Despite low development, bovine-murine interspecies nuclear transferred embryos could develop to blastocysts and they showed that blastocyts rate of antioxidant group was superior to those of non-antioxidant group. Next, we investigated gene expression pattern which is carried out for zygotic activation. The Xist gene is expressed in female mouse embryo after zygotic activation of 4-cell stage. But interspecies nuclear transferred embryos do not express Xist gene at 4-cell stage. As a result, it is suggested that the bovine cytoplasm controls the early preimplantation development in interspecies NT However, the development of later stages might require genomic control from transferred donor nucleus. Therefore, even though the involvement of several other factors such as mitochondrial incompatibility, effective development of embryos produced by interspecies NT requires proper genomic activation of donor nucleus after overcoming the cytoplasmic control of recipient oocytes.

• 한국임상수의학회지
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• 제22권4호
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• pp.318-321
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• 2005

충남 공주, 조치원, 연기 및 전북 익산 지역에서 사육 중인 만성유방염에 이환된 비유우 24두로부터 49분방을 선발하였다. 유방염에 이환된 49분방은 대조군(항생제 투여군: 7분방)및 실험군(ozonated oil투여군· 42분방)으로 각각 구분하였다. 또한 실험군의 분방은 우유 중 체세포를 기준으로 실험군 A(체세포 수$50-100\times10^4/ml)$ : 10분방), 실험군 B(체세포 수 $100-300{\times}10^4/ml)$ : 14분방) 및 실험군 C(체세포 수$>300\times10^4/ml$ : 18분방)로 각각 구분하였다. 대조군의 분방은 항생제 감수성시험의 결과를 토대로 norfloxacin(10g/tube)을 2회/1일, 3일간 유두내로 주입하였고, 또한 실험군의 분방에는 ozonated oil(200ppm 농도, 3일간 폭기) 10m1를 2회/1일, 3일간 유두내로 주입하였다. 대조군 및 실험군간 우유 중 체세포 수 및 세균수의 변화를 각각 비교 검토하였다. 그 결과 대조군의 분방은 처치 7일째 우유 중 체세포 수 및 세균수가 각각 감소 소견을 나타내었으나, 처치 전에 비하여 유의성이 인정되지 않았다. 한편 실험 군의 분방은 처치 후 7일째 처치 전에 비하여 체세포 수 및 세균수의 감소소견을 각각 나타내었으며, 특히 실험군 B(p<0.01) 및 실험군 C(p<0.01)에서 우유 중 체세포수는 처치 후 7일째에 처치 전에 비하여 각각 유의한 감소 소견을 나타내었다. 그러나 대조군 및 실험군 양 군간에는 체세포 수 및 세균수의 변화에 있어 유의성이 인정되지 않았다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, ozonated oil을 이용한 오존요법은 만성 유방염에 이환된 분방에 치료효과를 발휘할 수 있는 것으로 판단된다정할 때 꼭두서니 염료의 사용여부를 확인할 수 있는 대조구 화합물로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 퇴화 전후의 색차에 대한 측정결과는 퇴화에 따른 염료의 색 변화에 대한 결과이다 출토복식의 갈변현상은 염료의 변색과 더불어 토양 유기물에 의한 착색도 기인하므로, 출토복식의 색상 변화를 실질적으로 조사하기 위해서는 본 연구의 결과와 함께 토양유기물에 의한 착색에 대한 연구가 병행되어야 할 것으로 본다받고 또한 높은 수준의 직무 관여를 소매업 종사자들이 경험한다면, 그들의 직업 만족은 증가하고 이는 곧 장래에 그들이 소매업을 직업으로 선택하게 할 수 있는 가장 최우선적인 동력이라는 것을 확인하였다.TEX>연질, 대${\cdot}$소립의 영향과 높은 상관관계 가능성을 암시해주었다. R1과 R2분에서는 찰성밀이 일률적으로 보통밀보다 높은 수율을 지님으로서 배유조직의 제분특성에서 찰성밀이 보통밀보다 분말화가 용이하지 않음을 나타내 주었다.>${\~}$l16.9 RVU (SW97105) 범위로서 보통밀 148.0 (우리밀)${\~}$171.8 RVU (올그루밀)보다 낮았다.성에 영향을 주는 것으로 사료되고 이의 객관적 평가로는 KT-2000 관절 계측기가 유효한 것으로 생각된다.있었다. 또한 지단백중 스테로이드를 사용하기전의 HDL cholesterol, apoB, apoB/HDL cholesterol등은 관해 유도기간과 의미 있는 양의 상관관계를 보여서 신증후군 환아의 재발을 예측 할 수 있는 지표로서 임상적인 의미를 부여할 수 있을 것이다. 또는 세포독성물질로도 스테로이드 의존성을 없애거나 재발율을 낮출 수 없었던 스테로이드 의존성 미세변화형 신증후군의 치료에서는 스테로이드 의존성 혹은 재발율의 변화를 나타내지 못하였다. 따라서 장기간의 MP 요법은 스테로이드

• 한국수정란이식학회지
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• 제23권3호
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• pp.133-139
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• 2008

DNA methylation is one of the reasons for poor survival of clone animals. The OCT-4 gene is essential for maintaining pluripotency of embryonic stem (ES) cells and early embryos. We previously reported that the 5'-promoter region of Oct-4 gene was a target of DNA methylation and the methylation status was changed variously during embryonic development in bovine. The study conducted to examine the expression and methylation pattern of tissue-dependent differentially methylated region (T-DMR) of Oct-4 gene in bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT) and in vitro fertilization (IVF) blastocysts. The Oct-4 gene expression was evaluated by RT-PCR and fluorescence immunocytochemistry. The methylation pattern of T-DMR was analyzed using restriction mapping and bisulfite sequencing methods. The Oct-4 transcripts were highly expressed in IVF, while they were not expressed in SCNT. The Oct-4 protein was not detected or expressed at very low level in SCNT, the intensity of Oct-4 protein, however, was strong in IVF. On the other hand, the T-DMR of Oct-4 gene was hypermethylated in SCNT compared to that of IVF. These results suggested that expression and the failure of demethylation of Oct-4 gene was closely associated with incomplete development of SCNT embryos.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권1호
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• pp.33-39
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• 2002

소 체세포 핵이식 시 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도에 따른 융합율, 핵형의 변화, 배 발달율을 검토한 결과는 다음과 같다. 1. 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도를 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mM로 각기 다르게 처리한 결과, 0.5와 1.0 mM의 CaC$_2$에서 융합율이 80.5 와 84.3%로 나타나 0.05 mM CaCL$_2$에서의 융합율 56.6%에 비하여 유의적(P＜0.01)으로 높았다. 2. 융합액 내 $Ca^{2+}$ 농도에 따른 재구축배의 핵형을 검토한 결과, CaCL$_2$농도 0.05와 0.1 mM 에서는 88.4와 84.0%의 난자가 PCC이후 염색질괴를 형성한 반면, 0.5와 1.0 mM 에서는 54.5와 59.3%가 PCC 형태를 거치지 않고 직접 전핵을 형성하여, $Ca^{2+}$ 농도가 증가함에 따라 PCC 형태를 거치지 않고 직접 전핵을 형성하는 난자의 비율이 증가하였다. 3. 핵이식란의 체외 발육율을 검토한 결과, 1.0 mM CaCl$_2$에서는 배반포 발육율이 30.6%로 나타난 반면, 0.1 mM CaCl$_2$에서 는 20.0%로 나타나 유의적(P＜0.05)인 차이를 나타냈다. 본 연구의 결과는 융합액 내 $Ca^{2+}$농도의 증가가 소 체세포 핵이식란의 융합율 및 배반포 발육율을 향상시킬 수 있음을 시사한다.