• Mycobiology
• /
• 제45권4호
• /
• pp.385-391
• /
• 2017

The ability of Bacillus subtilis, strain ALICA to produce three mycolytic enzymes (chitinase, ${\beta}$-1,3-glucanase, and protease), was carried out by the chemical standard methods. Bacillus subtilis ALICA was screened based on their antifungal activity in dual plate assay and cell-free culture filtrate (25%) against five different phytopathogenic fungi Alternaria alternata, Macrophomina sp., Colletotrichum gloeosporioides, Botrytis cinerea, and Sclerotium rolfesii. The B. subtilis ALICA detected positive for chitinase, ${\beta}$-1,3-glucanase and protease enzymes. Fungal growth inhibition by both strain ALICA and its cell-free culture filtrate ranged from 51.36% to 86.3% and 38.43% to 68.6%, respectively. Moreover, hyphal morphological changes like damage, broken, swelling, distortions abnormal morphology were observed. Genes expression of protease, ${\beta}$-1,3-glucanase, and lipopeptides (subtilosin and subtilisin) were confirmed their presence in the supernatant of strain ALICA. Our findings indicated that strain ALICA provided a broad spectrum of antifungal activities against various phytopathogenic fungi and may be a potential effective alternative to chemical fungicides.

• 한국식품저장유통학회지
• /
• 제10권2호
• /
• pp.246-251
• /
• 2003

Bacillus subtilis PANH765 균주가 생산하는 pretense를 황산암모늄에 의한 염석, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sephacryl S 200 HR 및 Sepharose CL-6B gel filtration을 이용하여 정제하였다. DEAE-cellulose ion exchange chromatography를 행한 결과, 흡착 단백질 부분에서 활성이 높은 분획을 얻었다. 이 분획을 Sephacryl S 200 HR 및 Sepharose CL-6B gel filtration을 행한 결과 protease 활성을 가지는 단일 분획을 얻을 수 있었다. 정제한 protease의 분자량을 SDS-PAGE와 Sepharose CL-6B gel filtration으로 측정한 결과, 분자량은 35.0 kDa으로 추정되었으며, 각 효소의 비활성도는 6.27 U/mg이었으며, 회수율은 각각. 28.0%, 정제도는 4.35배로 나타났다. 최적 반응 온도는 $65^{\circ}C$, 최적 반응 pH는 7.05로 나타났으며, 온도 안정성은50 ∼ 75$^{\circ}C$, pH 안정성은 6.0 ∼ 7.5로 나타났다. 금속 이온의 영향은 $Na^{+}$, $K^{+}$, $Mg^{2＋}$ 및 NH$_4$$^{+}$ 이온이 효소 활성을 촉진하였으며, 그 중에서 $Mg^{2＋}$가 119.5%로 가장 높게 나타났다. 저해제인 경우 PMSF및 DFP에 의해 저해되었고 특히 DFP 보다는 PMSF 첨가시 뚜렷한 저해를 나타내었다.

• 농업생명과학연구
• /
• 제46권1호
• /
• pp.163-176
• /
• 2012

인천 연안 갯벌에서 분리한 호알카리성 Bacillus clausii I-52로부터 세포외 알카리성 단백질 분해효소(BCAP)의 발현 및 생산성을 증가시키기 위하여 BCAP promoter, ribosome 결합 서열, 신호서열, 전구체 서열 및 활성형 BCAP 유전자를 cloning한 재조합 plasmid pHPS9-fuBCAP을 penicillin-protoplast 법으로 B. clausii I-52의 염색체 DNA에 integration 하였고, 도입된 plasmid pHPS9-fuBCAP 유전자는 PCR에 의해 확인하였다. 가장 높은 단백질 분해효소 상대 활성을 보이는 선별된 transformant C5를 생산 최적화 배지(대두박 2%, 밀가루 1%, 구연산나트륨 0.5%, $K_2HPO_4$ 0.4%, $Na_2HPO_4$ 0.1%, NaCl 0.4%, $MgSO_47H_2O$ 0.01%, $FeSO_47H_2O$ 0.05%, 물엿 2.5%, 탄산나트륨 0.6%)에서 액침 배양법(배양온도, $37^{\circ}C$; 배양 시간, 48 h; 교반 속도, 650 rpm; 통기 속도, 1 vvm)으로 배양하여 단백질 분해효소를 발현 및 분비시켰을 때, BCAP 발현 양(134,670 U/ml)은 wild-type(83,960 U/ml)에 비하여 약 1.6 배 증가하였으며, 비활성도(91,611.5 U/mg 단백질)는 wild-type(71,760 U/mg 단백질)에 비하여 약 1.3 배 증가하였다. 또한, B. clausii I-52 염색체 DNA에 integration된 pHPS9-fuBCAP plasmid는 단백질 발현과 함께 8일간의 계대배양 동안에 안정하게 유지되고 있음을 확인하였다.

• 한국식품저장유통학회지
• /
• 제22권4호
• /
• pp.545-552
• /
• 2015

본 연구는 된장 제조 시 자연발효 시킨 control과, B. subtilis KACC15935, B. subtilis HJ18-9균주를 starter로 접종하여 발효시킨 팽화미된장의 효소활성과 품질특성을 측정하였다. 환원당을 유리하는데 관여하는 ${\alpha}$-amylase 효소활성의 경우 control과 HJ18-9를 접종한 시료에서 높게 나타났다. 또한 된장의 단백질을 분해하여 특유의 구수한 맛 성분을 유리하는 protease 활성의 경우도 control과 HJ18-9를 접종한 시료에서 높게 나타났으며, 이는 아미노태질소 함량에서도 같은 경향을 나타냈다. 또한 cellulose를 분해할 수 있는 능력을 가지고 있어 유용성분의 장내 이용성 증진을 위해 널리 사용되는 효소인 cellulase활성이 있는 HJ18-9균주를 처리한 접종구에서 $115.45{\pm}30.05unit/g$로 control과 B. subtilis KACC15935 처리구에서 $53.75{\pm}15.91$, $43.75{\pm}13.51unit/g$ 인 것에 비해 높게 나왔다. 이러한 결과로 본 연구를 통해 선별한 균주를 스타터로 접종하여 된장 제조에 알맞은 균주를 개발, 평가하여 가공품으로 개발의 기초연구가 되고자 하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제6권1호
• /
• pp.1-6
• /
• 1996

A bacterial strain NS70 producing an alkaline protease was isolated from soil samples taken near a hot spring and identified as Bacillus licheniformis by its morphological and physiological properties and cellular fatty acid analysis. The isolated alkaline protease was purified by ammonium sulfate fractionation, DEAE-, CM-, and Phenyl-Sepharose column chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 32, 000 Da by sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Its optimal pH and temperature for proteolytic activity against Hammarsten casein were 12 and $65^{\circ}C$, respectively. The enzyme was stable at alkaline pH range from 6.0 to 12.0, and fairly stable up to $65^{\circ}C$. The enzyme was inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride but not by EDTA and N-ethylmaleimide indicating that the enzyme is serine protease. Enzyme activity was markedly inhibited by $Hg^{2+}$ and $Cu^{2+}$. Autolytic phenomena were observed on purified protease NS70 but autolysis was reduced by the addtion of $Ca^{2+}$ ion or bovine serum albumin.

• Genomics & Informatics
• /
• 제21권3호
• /
• pp.35.1-35.12
• /
• 2023

The Bacillus cereus group, also known as B. cereus sensu lato (B. cereus s.l.), is composed of various Bacillus species, some of which can cause diarrheal or emetic food poisoning. Several emerging highly heat-resistant Bacillus species have been identified, these include B. thermoamylovorans, B. sporothermodurans, and B. cytotoxicus NVH 391-98. Herein, we performed whole genome analysis of two thermotolerant Bacillus sp. isolates, Bacillus sp. B48 and Bacillus sp. B140, from an omelet with acacia leaves and fried rice, respectively. Phylogenomic analysis suggested that Bacillus sp. B48 and Bacillus sp. B140 are closely related to B. cereus and B. thuringiensis, respectively. Whole genome alignment of Bacillus sp. B48, Bacillus sp. B140, mesophilic strain B. cereus ATCC14579, and thermophilic strain B. cytotoxicus NVH 391-98 using the Mauve program revealed the presence of numerous homologous regions including genes responsible for heat shock in the dnaK gene cluster. However, the presence of a DUF4253 domain-containing protein was observed only in the genome of B. cereus ATCC14579 while the intracellular protease PfpI family was present only in the chromosome of B. cytotoxicus NVH 391-98. In addition, prophage Clp protease-like proteins were found in the genomes of both Bacillus sp. B48 and Bacillus sp. B140 but not in the genome of B. cereus ATCC14579. The genomic profiles of Bacillus sp. isolates were identified by using whole genome analysis especially those relating to heat-responsive gene clusters. The findings presented in this study lay the foundations for subsequent studies to reveal further insights into the molecular mechanisms of Bacillus species in terms of heat resistance mechanisms.

• BMB Reports
• /
• 제37권3호
• /
• pp.298-303
• /
• 2004

In general, a SYPRO Ruby dye is well known as a sensitive fluorescence-based method for detecting proteins by one-or two-dimensional SDS-PAGE (1-DE or 2-DE). Based on the SYPRO Ruby dye system, the combined two-dimensional fibrin zymography (2-D FZ) with SYPRO Ruby staining was newly developed to identify the Bacillus sp. proteases. Namely, complex protein mixtures from Bacillus sp. DJ-4, which were screened from Doen-Jang (Korean traditional fermented food), showed activity on the zymogram gel. The gel spots on the SYPRO Ruby gel, which corresponded to the active spots showing on the 2-D FZ gel, were analyzed by a matrix-assisted laser desorption ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometric analysis. Five intracellular fibrinolytic enzymes of Bacillus sp. DJ-4 were detected through 2-D FZ. The gel spots on the SYPRO Ruby dye stained 2-D gel corresponding to 2-D FZ were then analyzed by MALID TOF MS. Three of the five gel spots proved to be quite similar to the ATP-dependent protease, extracellular neutral metalloprotease, and protease of Bacillus subtilis. Also, the extracellular proteases of Bacillus sp. DJ-4 employing this combined system were identified on three gels (e.g., casein, fibrin, and gelatin) and the proteolytic maps were established. This combined system of 2-D zymography and SYPRO Ruby dye should be useful for searching the specific protease from complex protein mixtures of many other sources (e.g., yeast and cancer cell lines).

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제29권2호
• /
• pp.110-114
• /
• 2001

가축 사료첨가용 probiotics용 균주를 얻기 위해 특히 내열성이 높아 가공사료에 적합한 Bacillus sp.를 위주로 하여 가축에게 유용한 효소인 phytase를 비롯하여 protease, cellulase, xylanase, amylase의 활성을 모두 나타내는 4-3 균주를 얻어 동정한 결과 Bacillus subtilis로 밝혀졌으며, 이를 B. subtilis 4-3으로 명명하였다. 본 균주를 원료사료에 순수배양하여 사료의 항영양인자인 phytic acid 분해율을 검토한 결과 대두박 및 쌀겨에 있어서는 phytic acid 분해율이 낮았으나, 밀기울의 경우 80.63%로 상대적으로 높은 phytic acid 분해율을 나타내었다. 원료 사료를 이용한 균주의 생산 조건은 대두박 1%(w/v)와 당밀 2%(w/v)가 가장 적합한 균주 생산을 위한 배지조성으로 검토되었다.

• 한국식품저장유통학회지
• /
• 제7권4호
• /
• pp.414-417
• /
• 2000

단백질분해효소를 생산하지 않는 균주 B. subtilis MT-2의 염색체 DNA를 추출한 다음, B. subtilis AC819 균주에 상동성 유전자재조합을 이용하여 competent cell 형질전환을 시켰다. 얻어진 형질전환체를 B. subtilis HL-1이라고 명명하였으며, 그 표현형은 histidine 요구성, streptomycin 내성, tetracyclin 내성을 나타내면서 단백질 분해효소를 생산하지 않았다. 플라스미드 pUB110 을 이용한 B. subtilis HL-1의 protoplst 형질전환율은 B. subtilis MT-2의 형질전환율보다 높았다. 따라서 새로운 B. subtilis HL-1균주는 단백질분해효소의 형질전환과 내열성 protease 유전자클로닝에서 숙주로 사용하는데 유용하다.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제39권6호
• /
• pp.460-465
• /
• 1996

한국재래간장으로 부터 분리한 Bacillus subtilis globigii CCKS-118가 생성하는 pretense 생산 최적조건은 2% soluble starch, 0.2% yeast extract, 0.1% $(NH_4)_2SO_4$, 0.2% $MgSO_4$, pH 7.5, $35^{\circ}C$에서 20시간이었다. 효소의 최적작용 pH와 온도는 pH 9.0, $50^{\circ}C$였으며, $pH\;6.0{\sim}11.0$의 범위와 $40^{\circ}C$이하에서 안정하였다. 금속이온중 $Cu^{2+}$에 의하여 활성이 증대되었으나 $Hg^{2+}$ 등에 의하여 효소활성이 저해되었다. Phenylmethylsuldonyl fluoride, ethylendiaminetetraacetic acid처리에 의해 활성이 저해되어 금속이온의 영향을 받는 serine pretense로 확인되었다. Km값은 $1.899{\times}10^{-4}M$, $V_{max}$값은 $34.36\;{\mu}g/min$이었으며, hemoglobin보다 casein을 더 잘 가수분해하였다.