Aspergillus niger KUF-04로부터 얻은 glucose oxidase는 결정화를 포함하여 7단계의 공정을 거쳐 순수하게 정제되었다. 공모양의 결정은 23배 정제된 효소액에서 얻어졌다. 분자량은 HPLC에 의해 210, 000, SDS-polyacrylamide electrophoresis에 의해 110,000을 나타냈으므로 본 효소는 동일한 2개의 subunit로 이루어진 단백질임을 알 수 있었다.
Katsuobushi에서 곰팡이, 세균, 효모 등 총 70여 균주를 분리하였으며 이중 곰팡이는 가다랑이 추출물에 밀기울을 가한 배지에서 생육이 양호하였다. protease활성이 높고 고미생성도가 적은 균주는 Aspergillus niger로 동정된 OK-63 strain이었으며 배양 6일만에 균체의 최대증식, protease의 최대 효소활성을 나타내었다. 효소정제는 150배 정제, 활성수율은 45%였으며 polyacryamide gel 전기영동에 의해 단일 band로 확인되었다.
Aspergillus niger KUF-04에서 얻은 catalase는 gel 여과를 포함하여 5단계를 걸쳐 정제하였으며, 9% 회수율로 64배 정제되었다. 본 효소는 406, 503, 625nm에서 흡광을 나타내었으며, 특히 406nm에서 뚜렷한 흡수대를 보여주었다. 이 효소 활성의 최적 pH와 온도는 각각 7.0과 6$0^{\circ}C$이었다. 이 효소는 pH4.0과 8.0 사이에서 안정했으며 열에 대한 안정성은 2$0^{\circ}C$에서 5$0^{\circ}C$까지는 안정했으나, 8$0^{\circ}C$에서 20분간 반응시켰을 때 효소의 활성이 전부 소실되었다. 이 효소의 활성은 주로 hydroxylamine, potassium cyanide, sodium azide에 의해 저해되었다.
A thermostable extracellular $\beta$-mannanase from the culture supernatant of a fungus Aspergillus niger gr was purified to homogeneity. SDS-PAGE of the purified enzyme showed a single protein band of molecular mass 66 kDa. The $\beta$-mannanase exhibited optimum catalytic activity at pH 5.5 and $55^{\circ}C$. It was thermostable at $55^{\circ}C$, and retained 50% activity after 6 h at $55^{\circ}C$. The enzyme was stable at a pH range of 3.0 to 7.0. The metal ions $Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, and $Ag^{2+}$ inhibited complete enzyme activity. The inhibitors tested, EDTA, PMSF, and 1,10-phenanthroline, did not inhibit the enzyme activity. N-Bromosuccinimide completely inhibited enzyme activity. The relative substrate specificity of enzyme towards the various mannans is in the order of locust bean gum>guar gum>copra mannan, with $K_m$ of 0.11, 0.28, and 0.33 mg/ml, respectively. Since the enzyme is active over a wide range of pH and temperature, it could find potential use in the food-processing industry.
Aspergillus niger K-25가 생산하는 내산성 ${\alpha}-amylase$를 정제하여 특성을 조사하였다. 분자량은 전기영동상에서 약 58,000달톤으로 나타났고, 최적 pH는 4였고, pH3에서 활성을 잃어 버리는 시판효소와 달리 본 효소는 91%의 활성을 유지했다. 최적 온도는 $40^{\circ}C$였으며, $60^{\circ}C$에서도 80%의 활성을 유지하여 열에 대한 안정성도 높은 것으로 나타났다.
Aspergillus niger SFN-416으로 부터 생성한 xylanase I를 분리.정제하여 특성을 조사하였다. Aspergillus niger SFN-416의 배양액을 ethanol(70%) 침전, $(NH_4)_2-SO_4$(30~90%) 침전, Sephadex G-100 chromatography 및 DEAE-Sephacel ion chromatography 등의 정제과정을 거친 결과, 10.2배 정제되었고, 정제효소의 최적 활성온도는 $50^{\circ}C$ 였다.최적 pH는 3.5이었고, pH 안정성은 6.0 이상에서 활성이 급격히 감소하였다. 또한 금속이온에 대한 효소의 활성은 대부분 억제를 보였고, 특히 $Hg^{2+}$는 18.5%로 가장 낮은 상대활성을 보였지만, $Fe^{2+}$는 117.0%, $Mn^{2+}$는 129.9%로 오히려 효소활성이 증가되었다. 정제 효소의 분자량은 SDS-PAGE에 의하여 31,000 daltons이 었으며, 유기용매에 대한 활성과 안정성은 10%의 methanol, ethanol, isopropanol 및 1-butanol 대하여 모두 낮은 활성을 나타내어 유기용매에는 안정하지 않는 것으로 생각된다.
$\beta $-Glucosidase (EC 3.2.1.21) was purified from Aspergillus niger SFN-416 by a sequential process of ammonium sulfate precipitation, Sepadex G-100 and DEAE-Sephacel column chromatography. Molecular weight of the enzyme was 46, 000 daltons. The K$_{m}$ and V$_{max}$ values for PNPG were 0.67 mM and 25 moles/ml $\cdot $min., respectively. The optimum pH and temperature of the enzyme activity were 3.5 and 58$\circ $C, respectively. The enzyme activity was decreased by addition of metal ions, and increased by addition of metanol, ethanol, isopropanol and 1-butanol at a concentration of 10% (v/v). Stability of the enzyme was increased by addition of isopropanol and 1-butanol at a concentration of 10% (v/v).
An alkaline protease produced by Aspergillus niger C-15 was purified and characterized. The enzyme was purified 19.41-fold with a specific activity of 74150 U/mg and a recovery of 34.4% by gel filtration and ion exchange chromatography. The molecular weight of the enzyme was estimated to be 34 kDa. The optimum pH and temperature for the protease activity were pH 8.0 and $60^{\circ}C$, respectively. The enzyme activity inhibited by EDTA suggests that the preparation contains a metalloprotease. The enzyme activity of the metalloprotease was completely inhibited by 5 mM $HgCl_2$ and $FeCl_3$, while partially inhibited by $CuSO_4$, and $MnCl_2$. When polyols such as glycerol, mannitol, sorbitol and xylitol, were added to the reaction medium, most polyols tested enhanced protease activity. Especially, glycerol showed the highest effect. The alkaline metalloprotease was stable at high temperature and retained more than 90% of the initial activity at $60^{\circ}C$ and 86.4% under addition of glycerol.
The carboxymethyl cellulase (CMCase) was purified from the induced culture filtrate of hybrid TAPW15703 between Aspergillus niger and penicillium verruculosum made by nuclear transfer. The enzyme was purified 80 fold with an overall yield 17% from the culture medium by ammonium sulfate fractionation, Sephadex G-75 gel permeation chromatography, and DEAE-ion exchange column chromatography. The molecular weight of the CMCase has estimated to be 32,000 daltons on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Sephadex G-150 gel permeation chromatography. The purified enzyme functions optimally at pH 4.0 and 4$0^{\circ}C$ The Km value for carbosymethyl cellulose was 68 mM. The enzyme activity was increased by the presence of $Mg^{2+}$and Mn$^{2+}$.
Aspergillus niger 균체로부터 황산암모늄 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 한외여과, 소수성 크로마토그래피 과정을 거쳐 glucose oxidase( EC 1.1. 3.4)를 순수 정제하였다. 최종 정제과정인 소수성 크로마토그래퍼에 의해 소수성은 다르나 glucose oxidase의 활성을 갖는 A, B fraction이 얻어졌고, 그의 비활성도는 각각 2,191, 1,273units/mg이었다. A와 B는 분자량 78,000의 당단백질임이 확인되었으나, HPLC 겔 여과로 측정한 분자량, 최대 흡수 파장, 등전점 등에 차이를 보였다. 효소 A는 $\beta$-D-glucose를 특이적으로 산화하였고, 촉매 활성에 대한 최적 온도 는 $30^{\circ}C$, 최적 pH는 3.5이었으며, SDS에 대하여 비교적 강한 저항성을 나타내었고, 촉매 기능은 10mM $Hg^{2+}$에 의해 급격히 억제되었다. 화학 수식 실험 결과 cysteine/ cystine중의 SH기가 glucose oxidase의 활성에 관여하고 있음이 시사되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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