• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권1호
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• pp.37-44
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• 1991

진핵세포 유전자의 기초대사발현의 조절계를 밝히기 위한 일환으로, 효모의 histidine생합성계 효소의 구조유전자 HIS5를 이용하였다. HIS5 유전자는 충분한 아미노산 조건하에서는 발현이 억제되어 비교적 높은 기초발현만을 하나, 어떤 아미노산이 결핍되면 탈억제되어 높은 발현량을 보이며 탈억제는 cis의 작용인자인 promoter상의 5'-TGACTC-3' 및 trans 작용인자 GCN4와 GCD17 GCN2등이 관여한다. trans 작용인자들에 의한 HIS5 유전자의 발현량의 변화를 간단하게 측정하기 위하여, HIS5 promoter와 repressible acid phoshates(APase)의 구조유전자중 promoter를 제거한 DNA단편을 연결시켜 HIS5-PHO5 융합유전자를 이용하였다. gcn2 및 gcn4 변이주의 APase 활성은 야생주와 비교하여 3내지 4배 낮았으며, gcn2변이주와 gcn2 gcn4 이중변이주의 APase 활성은 유사하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권6호
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• pp.568-574
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• 1991

효모에서 대랑의 물질생산계를 구축하기 위하여 먼저 여러 종류의 베터의 이용이 가능한 다양한 영양요구성 marker를 지니며 형질전환율이 향상된 효모숙주를 선별 개량하였다. 벡터의 제작에 사용되는 프로모터로는, 효모의 여러 유전자 중에서 그 활성이 매우 높은 해당계의 효소 GAP-DH의 구조 유전자 GAP를 이용하기로 하여, 효모염색체 DNA중에서 GAP 프로모터를 분리하여 이용하기 쉽게 변형하였다. 분리된 GAT promoter의 기능을 검토하기 위하여, reporter로 APase의 구조유전자 PHO5'를 이용하여 세포내의 copy수가 상이한 발현 벡터를 제작하여 GAP 프로모터에 의한 APase의 활성 및 전사산물을 측정한 결과, 정상적인 전사가 이루어 졌으며, 효소활성도 높게 나타났으며, 벡터의 copy수에 의한 효소활성의 차이도 감지되었다.

• 한국초지조사료학회지
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• 제17권3호
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• pp.285-292
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• 1997

This study was conducted to obtain the transgenic Brnssica napus plants with tobacco Apase gene using the binary vector system of Agrobacteriurn fumefociens. The results obtained were summarized as follows: A repressible acid phosphatase gene of Saccharon~yces cerevisiae, pho105 was used for screening of tobacco Apase cDNA. In order to identify Apase gene in tobacco genome, Southern blot analysis was pcrformed and the Apase gcnc may be present as a single copy, or at most two or three copies, in tobacco genome. To isolate the tobacco Apase gene, tobacco cDNA library was constructed using purifed mRNA from -Pi treated tobacco root and the plaque forming unit of the library was 2.8 x $10^5$ pfu/m${\ell}$, therefore the library might cover all expressed mRNAs. Using pho5 as a probe. tobacco Apase cDNA was cloned, and restriction mapping and Southern blot analysis of cDNA insert were revealed that the 3.6 kb cDNA contained tobacco acid phosphatase cDNA. Plasmid pGA695 -tcAPl was constructed by subcloning tobacco Apase cDNA into the Hind site of pGA695 with 35s promoter which can be expressed constitutively in plants. The Brassica napus cotyledonary petioles were cocultivated with the ,4 grobacteriunz and transferred to the selection medium. The transformed and regenerated plants were transplanted to soil medium. Southern blot analysis was done on the transformed plants, and it was confirmed that a foregin gene was stably integrated into the genonies of B. nnpus plants.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권2호
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• pp.272-279
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• 2006

The gene encoding Thermus sp. T351 alkaline phosphatase (T351 APase) was cloned and sequenced. The gene consisted of 1,503 bp coding for a protein with 500 amino acid residues including a signal peptide. The deduced amino acid sequence of T351 APase showed relatively low similarity to other Thermus APases. The T351 APase gene was expressed under the control of the T7lac promoter on the expression vector pET-22b(+) in Escherichia coli BL21 (DE3). The expressed enzyme was purified by heat treatment, and $UNO^{TM}$ Q and $HiTrap^{TM}$ Heparin HP column chromatographies. The purified enzyme exhibited high activity at extremely alkaline pHs, reaching a maximum at pH 12.0. The optimum temperature of the enzyme was $80^{\circ}C$, and the half-life at $85^{\circ}C$ was approximately 103 min. The enzyme activity was found to be dependent on metal ions: the addition of $Mg^{2+}$ and $CO^{2+}$ increased the activity, whereas EDTA inhibited it. With p-nitrophenyl phosphate as the substrate, T351 APase had a Michaelis constant ($K_{m}$) of $3.9{\times}10^{-5}M$. The enzyme catalyzed the hydrolysis of a wide variety of phosphorylated compounds.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권6호
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• pp.455-460
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• 1986

간염 보균자의 혈액으로부터 Dane 입자를 분리하였다. Dane 입자의 핵으로부터 분리해낸 DNA는 $\alpha$-($^{32}$P) dNTP 존재하의 DNA 폴리머레이즈 반응 후 액체 씬틸레이션 카운터와 한천 전기영동 및 가이거 뮐러 카운터에 의하여 간염의 DNA임이 확인되었다. 간염 바이러스에 의한 감염을 막기 위한 백신으로서의 B형 간염 바이러스 표면항원을 생산하기 위하여 산성포스파테이즈 프로모터를 갖는 재조합 프라스미드를 함유하는 효모균주를 사용하였다. 재조합 프라스미드는 pHBV 130 및 pAM 82로부터 제작되었으며 대장균에 변환되어진 후 효모균주에 전달되었다. 간염 표면항원은 조절된 무기 인산 농도하에서 버크홀더 최소배지에서의 저해 해제로 생산되었다. 간염 표면항원의 생산 속도도 조사하였다. 전체 간염 표면항원 활성은 인산이 없는 배지에 옮겨진 뒤 3시간 내지 6시간에서 급격히 증가하였으며 9시간째에 최대에 도달하였다. 인산이 없는 배지에 옮기는 것은 고농도 인산 배지에서의 세포 배양을 6시간동안 수행한 뒤에 하는 것이 최적의 결과를 나타내었다.