• 대한임상검사과학회지
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• 제56권2호
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• pp.115-124
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• 2024

플루오로퀴놀론(fluoroquinolone, FQ) 항균제 내성을 갖는 황색포도알균(Staphylococcus aureus)의 출현 및 확산으로 감염증 치료에 어려움을 겪고 있다. 이 퀴놀론 내성 황색포도알균(quinolone resistant S. aureus, QRSA) 에 대한 분자역학적 특성을 조사하여 치료에 도움을 주는 자료를 만들고자하였다. 대전광역시 소재 1개 종합병원에서 혈액배양 검체에서 분리된 QRSA 균주를 대상으로 mecA와 SCCmec 유전자형 분석에 따른, gyrA, gyrB 유전자의 돌연변이를 조사하였다. Ciprofloxacin 내성균주는 SCCmec typing에서 II형이 44개로 73%, IVa형이 5개로 8%, III와 V형이 1개로 2%, nontypeable 균주가 11개로 18%, levofloxacin, moxifloxacin은 II형이 44개로 73%, IVa형이 5개로 8%, III와 V형이 1개로 2%, non typeable 균주가 10개로 17%의 결과를 보였다. gyrA와 gyrB 영역 모두에서 58개로 96.7%, levofloxacin은 56개로 93.3%, moxifloxacin에는 57개로 95%를 나타냈다. QRSA 균주에 대한 gyrA와 gyrB의 돌연변이는 각각 6개씩 12개의 돌연변이가 확인되었다. 연구 대상 QRSA의 FQ 항균제의 내성률은 약 98%를 나타냈고, QRSA 균주에 대한 gyrA와 gyrB의 돌연변이는 각각 6개씩 12개의 돌연변이가 확인되었다.

• Fisheries and Aquatic Sciences
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• 제26권12호
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• pp.726-737
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• 2023

Piperine, the main bioactive component of black pepper (Piper nigrum Linn.), has anti-inflammatory, antifungal, and antibacterial properties. This study evaluated the supplemental effects of piperine or black pepper on innate immunity, growth, feed utilization efficiency, and intestinal morphology in red seabream (Pagrus major). Six experimental diets were formulated, supplementing piperine at 0.0, 0.25, 0.5, 1.0, and 2.0 g/kg levels (Con, P25, P50, P100, and P200) or 1.0 g/kg black pepper (BP100). Juvenile fish (7.6 ± 0.1 g) were randomly stocked into 18 circular tanks (220 L), including 30 fish per tank. Each diet was randomly assigned to triplicate groups, and the feeding trial was conducted for 8 weeks. The results showed that final body weight, specific growth rate, weight gain, and feed utilization efficiency were significantly improved (p < 0.05) when piperine was supplemented into diets at 0.25-2.0 g/kg levels compared to the Con group. Compared to the Con diet, condition factor was significantly increased (p < 0.05) in fish fed with dietary piperine at 0.25-2.0 g/kg or BP100 diet. Serum myeloperoxidase activity was increased (p < 0.05) in P25 and P100 groups and antiprotease activity was increased (p < 0.05) in P100 group compared to the Con group. Significantly higher (p < 0.05) lysozyme activity was observed in P50, P100, P200 and BP100 groups, while total immunoglobulin level was increased in P50, P100 and BP100 groups than Con group. Superoxide dismutase activity was increased (p < 0.05) by dietary piperine at 0.25-2.0 g/kg levels and BP100 diet compared to Con diet. Plasma cholesterol was significantly lower (p < 0.05) in fish fed with piperine (0.5-2.0 g/kg) or BP100 compared to the Con diet. Compared to the Con diet significantly longer (p < 0.05) intestinal villi were observed in fish fed with piperine at 0.25-1.0 g/kg levels, and higher goblet cell count was observed in P25 and BP100 groups. Dietary inclusion of piperine would be a potent immunostimulant in fish diet and the optimum supplementation level would be 0.25-1.0 g/kg.

• 한국식품영양과학회지
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• 제39권10호
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• pp.1528-1534
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• 2010

건강웰빙식품의 하나로서 수요가 증가하고 있는 새싹채소는 미생물학적 관점에서 안전성 확보방안이 요구되고 있다. 따라서 새싹채소의 병원성 미생물을 제거하기 위해 적무종자의 발아 전 침지동안 종자 소독처리에 따른 미생물 제어 효과와 발아율을 평가하였다. L. monocytogenes ATCC 19111가 3~4 log CFU/g의 농도로 접종된 적무 종자는 20,000 ppm calcium hypochlorite, 50 ppm과 100 ppm 염소수, 오존수, 전해산화수 및 전해환원수로 처리하였으며, 증류수에 침지시킨 종자를 대조군과 비교하였다. 발아율은 각 처리군에 대해 48시간 동안 조사하였다. 일반세균과 L. monocytogenes 모두 20,000 ppm calcium hypochlorite에 침지 후 3 logs 이상의 가장 큰 감소효과를 보였고, 염소수, 전해산화수와 전해환원수 침지 후 일반세균과 L. monocytogenes 수는 각각 3 logs와 2 logs 감소되었으며, 염소수와 오존수를 제외하고는 온도변화에 따른 유의적인 차이는 없었다. 종자 발아 후 일반세균 수는 모든 처리군에서, L. monocytogenes 수는 염소수 50 ppm과 오존수를 제외한 모든 처리군에서 대조군보다 유의하게 낮았으며, 염소수 100 ppm을 제외하고는 온도변화에 따른 유의적인 차이는 없었다. 발아율은 48시간 후 calcium hypochlorite(82.3~84.8%)를 제외하고 다른 모든 소독제 처리 시 93.5~97.7%로 나타났으며 대조군과 유의한 차이가 없었다. 이 연구에서 사용된 소독제 처리가 적무 종자에 접종된 L. monocytogenes를 완전히 사멸시키지는 못했지만, 발아 동안 재배수의 소독처리가 추가 병행된다면 생존한 균의 급속한 성장을 지연시킬 수 있을 것으로 사료된다.

• 치위생과학회지
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• 제13권2호
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• pp.213-221
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• 2013

구취감소와 구강청결의 목적으로 사용되는 구강 양치액과 음용수로 사용되고 있는 알칼리 이온수를 대상자 49명에게 적용하여, 사용 전 후 구강 내 상주하는 세균에 미치는 영향을 비교 평가를 위해 세균배양 및 광학현미경 관찰을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 배양 후 확인된 구강 양치액 사용 전 후 세균 수는 Hexamedin 71.29%로 가장 큰 감소율을 보였고, 이어 Listerine 62.25%, Caregargle 42.26%, Garglin 33.52%, saline 21.62%, alkaline ionized water 16.08%, distilled water 7.67%의 순으로 나타났다. 2. Wilcoxon's signed rank 검정 결과, Hexamedin에서 사용 후 세균 수의 감소가 유의하게 나타났고(p<0.05), 그 외 구강 양치액에서는 통계적인 차이는 보이지 않았다(p>0.05). 3. 그람염색 후 광학현미경 관찰 결과, 구강 양치액 및 알칼리 이온수 사용 전에는 다수의 구균과 일부 실사균이 관찰되었으나, 사용 후에는 대부분 구균이 관찰되었고, 실사균은 거의 관찰되지 않았다. 4. 구강 양치액 및 알칼리 이온수의 pH 차이는 구강 내 세균 수 변화에 영향을 미치지 않았다. 본 결과를 종합하면, Hexamedine과 Listerine의 구강 내 세균 감소율이 각각 71.29%, 62.25%로 나타나 치과치료 전 적용 시 효과가 높음이 입증되었다. 그 외 구강 양치액과 알칼리 이온수는 구강 내 세균 감소효과가 낮은 것으로 나타났다. 그리고 세균 감소는 pH 보다는 구강 양치액에 포함된 항균 물질의 성분이 영향을 주는 것으로 생각된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제42권3호
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• pp.295-301
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• 1995

연구배경: 우리나라에서 1979년까지의 초치료는 INH + SM + PAS(또는 EMB)의 18개월 요법이 표준처방으로 이용되었고 1980년대에 들어와서 INH + EMB + RFP의 9개월 요법을 설시하다가 INH + RFP + PZA + EMB(또는 SM)의 6개월 표준 단기요법이 정착되었다. 그후 폐결핵의 초치료 성적은 매우 괄목할만한 결과를 보여 주었으나 초치료 실패 및 재치료 실패 환자들의 경우 약제 내성균 빈도가 증가함에 따라 사용 가능한 약제가 매우 제한될 수 밖에 없었다. 1980년대에 개발된 Quinolone 계통의 Ofloxacin(OFX)은 광범위 항생제로서 호흡기 절환을 비롯한 여러 감염성 질환에 널리 사용되어 오고 있을 뿐만 아니라 최근에는 폐결핵의 치료에도 일부 사용되고 있으며 그 효능 또한 입증된 바 있다. 이에 재치료 처방으로 PTA + CS + OFX와 주사제로서 Streptomycin(SM), Kanamycin(KM), Tuberactinomycin(TUM) 중 하나를 첨가한 4제 요법으로 치료받았던 환자를 대상으로 하여 임상효과를 조사하였다. 방법 1991년 3월부터 1994년 6월까지 국립 공주 결핵병원에 입원하였던 도말양성 환지중 초치료 또는 재치료에 실패한 환자 92명을 후향적으로 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 결과: 1) 객담도말 양성환자 92명중 67명(73%)에서 균음전되었다, 2) 균음전시기는 치료시작후 1개월 이내에 24명(36%)로 제일 많았고 4개월 이내에 85%의 균음전율을 보였다. 3) 흉부 엑스선 사전의 호전은 전체적으로 49% 이였고 균음전율은 흉부 엑스선상 경증, 중등증, 중증에서 각각 100%, 93%, 68% 이었다. 4) 균음전율은 1년미만, 1년에서 3년미만, 3년에서 5년미만, 5년이상의 질병기간에서 각각 87%, 76%, 65%, 그리고 55% 이었다. 5) PTA의 부작용은 위장장애가 대부분 이었으며 간기능장애, 경련이 각각 7%, 1% 나타났다. CS의 부작용은 신기능장애, 정신병, 경련이 각각 2%, 1%, 1% 이었고, KM에 의한 이명은 1%, OFX에 의한 설사는 4% 이었다. 결론: 환자의 병력이 짧을수록, 흉부 엑스선상 경증와 중등증 일수록 좋은 성적을 보여 주었다. 초치료 실패환자에서 흉부 엑스선상 중증으로 이행되기전에 재치료가 성공적으로 이루어지면 균음전은 물론 흉부 엑스선성 호전도 보여줄 수 있다. 소수 2차 항결핵제가 부작용으로 중단된 경우도 있었지만, 2차 항결핵제의 부작용은 대부분 위장장애을 호소하기 때문에 환자의 협조하에 규칙적으로 복용토록 하여 완치 퇴록하는 것이 바람직하다고 사료된다.

• Pediatric Infection and Vaccine
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• 제18권1호
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• pp.23-30
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• 2011

목 적 : A. baumannii는 원내 감염의 중요한 원인으로 다양한 감염증을 일으키고 있으며, 다양한 항생제에 대하여 내성을 가지고, 다약제 및 범약제 내성도 점차 증가하고 있어 그 중요성이 높아지고 있다. 이에 소아에서의 A. baumannii 감염 현황 및 내성 발생 현황을 알아보고자 연구를 시행하였다. 방 법: 2001년 1월 1일부터 2008년 12월 31일까지 세브란스 병원에 입원치료 하였던 19세 이하의 소아환자 중 A. baumannii가 동정된 환자 505명, 680례에 대하여 후향적 방법으로 조사하였다. 다약제 내성은 3가지 이상의 항생제 그룹에 대하여 내성을 나타내거나 carbapenem에 대하여 내성을 나타내는 경우로 정의하였고, 범약제 내성은 세브란스 병원에서 항생제 감수성을 검사하는 모든 항생제에 내성을 나타낼 경우로 정의 하였다. A. baumannii의 감염빈도 및 항생제 내성 발생 현황의 연도별 추이에 대하여 조사하였으며, 재원장소, 항생제 사용 유무, 기계 호흡유무 등에 따른 감염빈도 및 다약제, 범약제 내성 발생의 차이에 대하여 조사하였고, 이에 대해 카이제곱 검정, t-검정을 사용하여 통계적 유의성 여부를 알아보았다. 결 과 : A. baumannii 가 동정된 환자들의 기저질환은 혈액종양성 질환, 신경계 질환이 각각 208례(30.6%), 165례(24.3%)로 가장 많았으며, 만성소모성 질환이 많았다. 객담과 소변검체에서 많이 동정되었다. A. baumanii의 검출 빈도는 항생제를 사용하였던 환자들에서 78.1%로, 사용하지 않은 그룹에 비하여 더 높았다. 다약제 내성 및 범약제 내성 A. baumannii의 발생빈도는 중 환자실 재원의 경우 각각 76.4%, 38.3%였고, 기계호흡을 하였던 경우 76.8%와 38.9%로 일반병실 재원 환자 및 기계호흡을 하지 않았던 환자보다 더 높은 빈도를 보였다. 연도별 발생추이는 2001년부터 2004년까지 증가 하다가 2005년 대폭 감소하였으며 이후 다시 증가하여 2008년에는 다약제 내성균주가 63.5%, 범약제 내성균주가 48.2%에 이르렀다. 항생제 내성균의 증가는 모든계열의 항생제에서 나타나고 있으며 2008년에는 모든계열의 항생제가 50% 이상의 내성률을 나타내었다. 항생제 내성은 중환자실 재원여부, 항생제 사용 및 기계호흡 여부와 상관하여 증가하였다(P <0.0001). 결 론:소아에서의 다약제내성, 범약제내성 A. baumannii의 증가는 항생제 과다사용 및 내성 균주의 전파 때문으로 생각되며, 철저한 환경관리가 A. baumannii 감염으로의 이환 및 내성 균주 발생 방지에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

• 대한소아치과학회지
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• 제40권4호
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• pp.241-246
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• 2013

이 연구의 목적은 치과 임상에서 널리 사용되는 항미생물제제인 클로르헥시딘과 할로겐을 이용한 erythrosine 광역동 치료를 병용하였을 때, 부유 상태의 Streptococcus mutans에 미치는 항균효과를 평가하기 위함이다. S. mutans 표준 균주를 Brain Heart Infusion broth medium에 첨가하여 부유 상태로 배양하였다. 치과용 할로겐 광중합 장치를 광원으로 사용하였으며 치태 착색제인 erythrosine을 광감각제로 사용하였다. 클로르헥시딘의 최소살균농도를 측정하고, erythrosine 광역동 치료에서 최소살균농도를 결정하기 위해 $1{\mu}M$, $5{\mu}M$, $10{\mu}M$의 erythrosine 농도를 사용하여 할로겐 광중합기로 15초 동안 광조사를 시행한 후 세균수를 측정하였다. 마지막으로 클로르헥시딘과 erythrosine 광역동 치료를 병용한 경우 나타나는 상승효과를 평가하기 위해, 최소살균농도 이하인 0.001% 클로르헥시딘과 최소살균농도 이하인 $1{\mu}M$ erythrosine 광역동 치료를 병용하여 항균효과를 비교하였다. 최소살균농도 이하의 클로르헥시딘만 단독으로 사용하는 경우 S. mutans의 세균수가 유의하게 감소하지 않았다(p < 0.05). 또한 erythrosine 광역동 치료만 단독으로 시행한 경우에는 $5{\mu}M$, $10{\mu}M$의 erythrosine 농도에서 유의하게 세균수가 감소하였지만, $1{\mu}M$ erythrosine 농도에서는 세균수가 유의하게 감소하지 않았다(p < 0.05). 마지막으로 두 가지 치료법의 상승효과를 평가하기 위해 최소살균농도 이하인 $1{\mu}M$ erythrosine 광역동 치료와 0.001% 클로르헥시딘을 병용하는 경우에는, 대조군과 비교하여 세균수가 유의하게 감소하였다(p < 0.05). 최소살균농도 이하인 0.001% 클로르헥시딘과 $1{\mu}M$ erythrosine 광역동 치료를 각각 단독으로 시행하는 경우에는 유의한 항균효과가 없었지만, 두 가지 치료를 병용하는 경우 61%의 S. mutans 세균수가 감소하였다. 이상의 결과를 종합해 볼때 S. mutans에 대해 최소살균농도 이하의 클로르헥시딘과 erythrosine 광역동 치료를 병용하는 경우 상승효과가 있음을 알 수 있다.

• 한국축산식품학회:학술대회논문집
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• 한국축산식품학회 2004년도 정기총회 및 제33차 춘계 학술대회
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• pp.89-119
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• 2004

This study was conducted to isolate lactobacilli having probiotic characteristics to be used as health adjuncts with fermented milk products. Acid tolerant strains were selected in Lactobacilli MRS broth adjusted to pH 4.0 from 80 healthy persons (infants, children and adults). And bile tolerant strains were examined in Lactobacilli MRS broth in which 1.0% bile salt was added. By estimation above characteristics, the strains No. 27, which was isolated from adult feces, was selected and identified as Lactobacillus salivarius subsp. salivarius based on carbohydrate fermentation and 16S rDNA sequencing. It was used as a probiotic strain in fermented milk products. The pH of fermented milk decreased from pH 6.7 to 5.0 and titratable acidity increased from 0.3% to 1.0% by L. salivarius subsp. salivarius (isolation strain 20, 35, and 37), when incubated for 36 h at $37^{\circ}C$. The number of viable cell counts of fermented milk was maximized at this incubation condition. The SDS-PAGE evidenced no significant change of casein but distinct changes of whey protein were observed by isolated L. salivarius subsp. salivarius for titratable acidity being incubated by $0.9{\sim}1.0%$ at $37^{\circ}C$. All of the strains produced 83.43 to 131.96 mM of lactic acid and 5.39 to 26.85 mM of isobutyric acid in fermented products. The in vitro culture experiment was performed to evaluate ability to reduce cholesterol levels and antimicrobial activity in the growth medium. The selected L. salivarius subsp. salivarius reduced $23{\sim}38%$ of cholesterol content in lactobacilli MRS broth during bacterial growth for 24 hours at $37^{\circ}C$. All of the isolated L. salivarius subsp. salivarius had an excellent antibacterial activity with $15{\sim}25$ mm of inhibition zone to E. coli KCTC1039, S. enteritidis KCCM3313, S. typhimurium M-15, and S. typhimurium KCCM40253 when its pH had not been adjusted. Also, all of the isolated L. salivarius subsp. salivarius had partial inhibition zone to E. coli KCTC1039, E. coli KCTC0115 and S. enteritidis KCCM3313 when it had been adjusted to pH 5.7. The selected strains were determined to have resistances of twelve antibiotic. Strains 27 and 35 among the L. salivarius subsp. salivarius showed the highest resistance to the antibiotics. Purified ${\alpha}$-galactosidase was obtained by DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatography, Mono-Q ion exchange chromatography and HPLC column chromatography from L. salivarius subsp. salivarius 27. The specific activity of the purified enzyme was 8,994 units/mg protein, representing an 17.09 folds purification of the original cell crude extract. The molecular weight of enzyme was identified about 53,000 dalton by 12% SDS-PAGE. Optimal temperature and pH for activity of this enzyme were $40^{\circ}C$ and 7.0 respectively. The enzyme was found to be stable between 25 and $50^{\circ}C$. ${\alpha}$-galactosidase activity was lost rapidly below pH 5.0 and above pH 9.0. This enzyme was liberated galactose from melibiose, raffinose, and stachyose, and also the hydrolysis rate of substrate was compound by HPLC. These results indicated that some of the L. salivarius subsp. salivarius (strain 27 and 35) are considered as effective probiotic strains with a potential for industrial applications, but the further study is needed to establish their use as probiotics in vivo.

• KSBB Journal
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• 제24권2호
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• pp.156-162
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• 2009

과메기를 표준화하는 일환으로 감압건조기 (vacuum drying)를 사용하여 CA (chitosan-ascorbate)로 표면을 coating한 것과 시중에서 판매되고 있는 일반 과메기와 미생물오염도를 비교분석 하였다. Total aerobacter에서 SCA (CA 처리한 꽁치 과메기)는 1.41, SGRW (ginseng steamed red, wine으로 처리한 꽁치 과메기)에서 1.63, SNT (CA 비처리한 시중판매 과메기) 에서는 1.9 log cycle 오염된 것을 비교하면 SCA가 0.22-0.49 log cycle 항균효과를 보인다. HCA (CA 처리한 청어과메기)에서는 2.27, HDW (심층수로 처리한 청어과메기) 2.32, HNT (비처리한 청어과메기) 2.72로서 오염도를 비교하면 HCA는 0.05-0.45 log cycle을 억제시켰다. GCA (CA 처리한 전어과메기)에서는 0.95, GDW (심층수로 처리한 전어과메기)와 GNT (비처리한 전어과메기)가 1.4의 수치를 나타내어서, GCA는 비처리한 GNT와 비교할 때 0.45 log cycle을 저해시켰다. Coliform과 E. coli에서는 오염미생물이 검출되지 않았다. S. aureus는 SCA 에서 0.47, SGRW 1.15, SNT 1.27로 조사되어 미생물 오염도를 비교하면 SCA는 0.68-0.8 log cycle의 오염미생물을 억제시킨다. HCA는 1.15, HDW 1.11, HNT 1.36과 비교하면 HCA는 오염미생물 0.21 log cycle을 저해시켰다. GCA는 0.47, GDW와 GNT가 1.08과 1.34로 검출되었다. 즉 GCA에서는 오염된 미생물 0.26-0.61 log cycle 오염미생물을 억제시킨다. 수분함량 측정의 결과는 GDW 29%, HCA 31%, HNT 32%로 조사되어서 적당한 수분함량을 보유하고 있으나, SGW, GCA, HDW, SCA는 7-15%가 부족하며, SNT 와 GNT는 과메기 표준수분함량 (30%) 보다 10%가 더 많아서 미생물의 오염과 과산화물 증가 및 산패를 더 빨리 초래 한다. CA를 첨가하였을 때 과산화물은 SCA 41, HCA 45, GCA 49 meq로 조사되었으며, 항균성을 첨가하지 않은 시중과메기 (SNT, HNT, GNT)와 비교할 때 과산화물이 12 meq 더 낮게 조사되었다. SEM 관찰에서는 SCA, HCA가 조직표면이 선명하고 과산화물이 낮게 검출되었으며, 반면 항균성을 처리하지 않은 SGRW, HDW는 과산화물이 많으며 조직표면이 불투명하였다. 관능평가에서는 SCA, SGW 등의 순으로 꽁치 과메기 선호도가 가장 높았으며, 다음으로 청어, 전어 과메기 순으로 조사되었다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제34권2호
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• pp.170-177
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• 2019

본 연구는 이산화염소 가스를 생성하는 앰플을 이용하여 6.5 L 용기에서 살균효과와 소취효과를 확인하였고, 소독장에서 이산화염소 가스 농도의 변화 및 S. aureus KCTC 1916와 E. coli KCTC 1682에 대한 살균 효과를 확인하였고, 소독장안에서 작업화 내부의 살균 효과 또한 확인하였다. 앰플은 6.5 L 용기에서 S. aureus KCTC 1916와 E. coli KCTC 1682에 대해 살균 효과가 있었다. 또한 포름알데히드에 대해서는 소취효과가 없었지만 암모니아와 페놀에는 효과가 있었다. 이산화염소 가스의 최대 농도는 앰플의 수가 많아 질수록 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 앰플 4개는 최대 2.8 ppm, 6개일 때는 최대 4.6 ppm이었으며, 앰플 12개를 이용하였을 때는 이산화염소 가스 농도를 측정할 수 없었지만 앰플 수와 농도가 비례적으로 상승하는 것을 고려하여 최대 8.5~9.0 ppm 으로 추정할 수 있었다. 또한 순환팬을 가동하게 되면 5배 이상의 농도 감소가 발생하였다. S. aureus KCTC 1916는 24시간 처리하였을 때 앰플 4개는 0.49 log CFU/plate, 6개는 1.2 log CFU/plate 그리고 12개는 2.98 log CFU/plate 감소되었다. E. coli KCTC 1682는 24시간을 처리하였을 때 4개, 6개, 12개 순서로 0.16 log CFU/plate, 2.68 log CFU/plate, 6.06 log CFU/plate 감소하였다. 작업화 내부에 대해 24시간 동안 처리하였을 때 앰플 6개를 사용한 경우 S. aureus KCTC 1916와 E. coli KCTC 1682 는 각각 1.22 log CFU/plate, 2.10 log CFU/plate 감소하였고 12개로 처리한 것은 2.69 log CFU/plate, 4.41 log CFU/plate 감소하였다.