• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제55권1호
• /
• pp.41-58
• /
• 2003

연구배경 : 약제내성 결핵권의 조기 진단을 위해서, 최근 돌연변이 검출 및 질병의 진단 등에 새로운 기술로 대두되고 있는 올리고뉴콜레오티드 칩 기술을 이용하여 결핵균의 리팜핀, 아이소나아지드와 스트렙토마이신 내성과 관련된 rpoB, katG와 rpsL 유전자의 주요 돌연변이를 신속하고 정확하게 검출하고자 하였다. 방 법 : 리팜핀 내성 검출의 야생형 7개와 돌연변이형 13개, 아이소니아지드 내성 검출의 야생형 2개와 돌연변이형 3개, 그리고 스트렙토마이신 내성 검출을 위한 야생형과 돌연변이형 프로브 각 2종류를 고안한 후, 유리 슬라이드에 고정시켜 올리고뉴클레오티드 칩을 제작하였고, 약제내성을 가지고 있는 배양균주 55균주를 선택하여 PCR 증폭반응과 혼성화 반응을 실시한 후 비공초점 레이저 스케너를 이용하여 돌연변이를 검출하였다. 이를 염기서열방법으로 확인하여 돌연변이 다형성을 분석하였다. 결 과 : 리팜핀 내성은 코돈 531과 코돈 526에서 65%의 돌연변이를 검출하였고, 현재까지 보고되어 있지 않은 D516F의 새로운 돌연변이도 검출하였다. 아이소니아지드 내성은 S315T와 R463L 돌연변이가 45.2%로 검출되었고, 스트렙토마이신 내성은 K43R과 K88R 돌연변이가 78%로 검출되었다. 리팜핀 내성의 88%(35/40), 아이소니아지드 내성의 50%(20/42), 그리고 스트렙토마이신 내성의 78%(7/9)를 검출함으로써 현재까지 보고되어 있는 세가지 약제내성과 관련된 rpoB, katG와 rpsL 유전자의 주요 돌연변이는 대부분 검출할 수 있음을 확인할 수 있었고, 염기서열분석 결과와 비교하였을 때 모두 일치하는 결과를 얻음으로써 올리고뉴콜레오티드 칩의 유용성을 확인할 수 있었다. 결 론 : 따라서 본 연구에서 개발한 올라고뉴클레오티드 칩은 약재내성 결핵균의 조기 진단에 유용한 도구가 될 것으로 사료된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제19권3호
• /
• pp.323-330
• /
• 2009

Nontuberculous mycobacteria (NTM) are a major cause of opportunistic infections in immunocompromised patients, making the reliable and rapid identification of NTM to the species level very important for the treatment of such patients. Therefore, this study evaluated the usefulness of the novel target genes tuf and tmRNA for the identification of NTM to the species level, using a PCRrestriction fragment length polymorphism analysis (PRA). A total of 44 reference strains and 17 clinical isolates of the genus Mycobacterium were used. The 741 bp or 744 bp tuf genes were amplified, restricted with two restriction enzymes (HaeIII/MboI), and sequenced. The tuf gene-PRA patterns were compared with those for the tmRNA (AvaII), hsp65 (HaeIII/HphI), rpoB (MspI/HaeIII), and 16S rRNA (HaeIII) genes. For the reference strains, the tuf gene-PRA yielded 43 HaeIII patterns, of which 35 (81.4%) showed unique patterns on the species level, whereas the tmRNA, hsp65, rpoB, and 16S rRNA-PRAs only showed 10 (23.3%), 32 (74.4%), 19 (44.2%), and 3 (7%) unique patterns after single digestion, respectively. The tuf gene-PRA produced a clear distinction between closely related NTM species, such as M. abscessus (557-84-58) and M. chelonae (477-84-80-58), and M. kansasii (141-136-80-63-58-54-51) and M. gastri (141-136-117-80-58-51). No difference was observed between the tuf-PRA patterns for the reference strains and clinical isolates. Thus, a diagnostic algorithm using a tuf gene-targeting PRA is a promising tool with more advantages than the previously used hsp65, rpoB, and 16S rRNA genes for the identification of NTM to the species level.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제59권3호
• /
• pp.257-265
• /
• 2005

연구 배경 : 리팜핀 내성 균주에서 리파부틴 약제의 교차 내성정도와 리팜핀 내성-리파부틴 감수성 결핵균의 rpoB 유전자 돌연변이의 특성을 알아보고자 연구를 실시하였다. 연구 방법 : 감수성검사에서 리팜핀에 내성인 균주를 선정하여 리파부틴 농도 $0-80{\mu}g/ml$ 농도로 재접종하여 감수성 여부를 확인하였다. 리팜핀-내성균주 모두 염기서열 분석을 통하여 리파부틴 감수성과의 관계를 조사하였다. 역교잡 방법으로 리파부틴 감수성균을 구별하였다. 연구 결과 : 우리나라에서 분리된 리팜핀 내성인 201균주 중에서 41균주(20.4%)는 리파부틴에 감수성을 보였다. 리파부틴 감수성을 보이는 rpoB 유전자 돌연변이는 Leu511Pro, Ser512Arg, Gln513Glu, Asp516Ala, Asp516Gly, Asp516Val, Asp516Tyr, Ser522Leu, His526Asn, His526Leu, His526Cys, Arg529Pro, Leu533Pro 등 이었다. 역교잡 방법을 이용하였을 경우 rpoB 돌연변이를 가진 균주 중에서 리파부틴 감수성균의 민감도는 92.5%이었고, 특이도는 96.1%이었다. 결 론 : 리팜핀 내성균이라도 약 20.4% (95% 신뢰구간: 14.8% to 26.0%)가 리파부틴 약제에 감수성이므로, 우리나라의 다제내성 결핵환자의 치료에서도 리파부틴이 중요한 약제로서 역할을 할 수 있음이 밝혀졌다. 향후 다제내성 결핵 환자에서의 리파부틴의 치료 효과에 대한 임상적 연구가 필요하다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제45권6호
• /
• pp.1178-1187
• /
• 1998

연구배경 : Pyrazinamide(PZA)는 대식세포(macrophage)내의 결핵균에 주로 작용하는 항결핵약제로서 단기화학요법의 중요한 요소이다. 최근 서구에서 AIDS 발생의 증가와 함께 약제내성 결핵의 발생이 증가하면서 약제내성을 조기에 발견하려는 노력이 시도되고 있다. 현재 우리나라에서는 PZA 감수성 검사 대신에 pyrazinamidase(PZase) 활성도 유무로 PZA에 대한 내성여부를 판별하고 있다. 최근 결핵균의 PZase를 coding하는 pncA 유전자가 밝혀졌고 이 유전자의 돌연변이가 결핵균의 PZA 내성에 관여한다는 보고가 있었다. 이에 본 연구자는 결핵균의 pncA 유전자를 대상으로 한 PCR-SSCP 법으로 PZA 내성여부를 진단할 수 있는지 알아보기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방 법 : 환자에서 추출되어 배양후 대한결핵연구원에서 PZase 활성도가 확인된 44예의 결핵균주와 대한결핵연구원에서 공여받은 BCG-French Strain, BCG-Tokyo strain, 그리고 1예의 우형결핵균 배양검체를 대상으로 하였다. 검체에서 bead beater 법으로 DNA를 추출하였으며 pncA 유전자를 포함하는 561bp 분절을 중합효소연쇄반응으로 증폭하였다. 이 증폭된 DNA를 BstB I 제한효소로 절단한 후 폴리아크릴아마이드젤에서 SSCP를 시행하여 그 결과를 표준균주 H37Rv와 비교하였다. 결 과 : 44예의 결핵균 중 22예는 PZase 활성도 양성이었고 22예는 PZase 활성도 음성이었다. 양성 22 예중 18예(82%)에서 표준균주인 H37Rv와 동일한 band의 이동성을 보였고 4예는 다른 band의 이동성을 보였다. 음성균주 22예중 19예(86%)에서 H37Rv와 다른 band의 이동성을 보였고 3예는 H37Rv와 동일한 band의 양상을 보여서 두 검사방법간의 관련성 검증 결과 통계적으로 유의하였다 (p<0.01). 근본적으로 PZA에 내성을 갖는 BCG strains과 1예의 우형결핵균 모두 H37Rv와 다른 band의 양상을 보여주었다. 결 론 : 결핵균의 PZase를 coding하는 pncA 유전자를 이용한 PCR-SSCP 법은 PZA 내성의 진단방법으로 기대된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제43권6호
• /
• pp.842-851
• /
• 1996

연구배경: Rifampicin(RFP)은 항결핵 단기지료의 근간이 되는 약제로서 RFP에 대한 내성을 다제약제내성의 지표로 보기도 한다. rpoB유전자는 RFP이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA poly-merase의 ${\beta}$-subunit을 coding하는 유전자이다. 다른 보고들에 의하면 RFP내성균주에서 rpoB유전자의 돌연변이가 관찰되고 특히 점돌연변이가 중요한 기전임이 알려지고 있다. 이에 저자는 rpoB유전자의 점돌연변이를 쉰게 관찰할 수 있는 PCR-SSCP법 을 이용하여 신속하게 RFP에 대한 내성여부를 확인할 수 있는지에 대하여 알아보았다. 방법: 전통적인 약제내성검사상 RFP에 내성을 보이는 25 배양균주와 RFP에 감수성인 27 배양균주 그리고 표준균주인 H37Rv를 대상으로 하였다. TR8, TR9 primer를 이용하여 rpoB 유전자의 511 codon에서 533 codon 부위를 포함하는 157bp의 DNA를 증폭한 후 폴리 아크릴아마이드젤 전기영동으로 PCR-SSCP를 시행하여 band의 이동양상을 비교하였다. 그리고 H37Rv 와 다른 band의 양상을 보인 균주에서 direct sequencing을 시행하여 H37Rv의 염기서열과 비교하였다. 또한 임상결과를 추적할 수 있었던 19예에서 임상결과와 전통적인 감수성검사 결과, 그리고 PCR-SSCP결과를 비교하였다. 결과: 1) PCR-SSCP결과로 RFP감수성 27균주 모두에서 H37Rv와 동일한 band의 양상을 보였고, RFP내성 25균주 모두에서 H37Rv와 다른 band의 양상을 보여서 전통적인 RFP 감수성검사와 rpoB유전자의 PCR-SSCP 사이에 100% 일치하는 결과를 보여주었다. 2) rpoB 유전자 돌연변이의 주된 기전은 점돌연변이였다. 3) rpoB 유전자의 PCR-SSCP 결과는 전통적인 RFP감수성검사나 항결핵치료의 임상경과와 잘 일치하였다. 결론: 결핵균 rpoB 유전자의 PCR-SSCP에 의한 돌연변이의 확인은 RFP내성 결핵균의 신속한 진단에 아주 유용한 검사로 기대된다. 향후 직접임상검체를 대상으로 한 연구가 필요하리라 사료된다.