해양 세균을 이용하여 규조류, Chaetoceros spp. 적조의 방제기술 개발을 위한 목적의 일환으로 우리나라 연안에서 분리된 Alteromonas sp. SR-14가 여러 가지 조건하에서 Chaetoceros calcitrans의 증식에 미치는 영향을 조사하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. Alteromonas sp. SR-14를 C. calcitrans와 혼합배양하였을 때 조류 증식 저해활성은 $20^{\circ}C$에서는 강하였으나 $25^{\circ}C$ 이상에서는 활성이 없었다. 그리고 C. calcitrans의 초기농도가 약 $10^4$ cells/ml이었을 때 Alteromonas sp. SR-14를 10 cells/ml 이하만 접종하여도 증식을 저해하였다. Alteromonas sp. SR-14는 대수기의 C. calcitrans에 대해서 저해 활성이 강하였고, 무기 영양염의 첨가나 1,300$\~$4,600 lux에서 조도변화 및 200 rpm으로의 진탕 등의 배양조건은 세균의 조류증식 저해활성에 영향을 미치지 않았다.
일반적으로 규조류는 무독한 적조생물로 알려져 있으나, Chaetoceros spp.의 특정한 종은 적조를 형성할 경우 수산생물에 직$\cdot$간접적인 영향을 미치기도 한다. 본 연구는 해양 세균을 이용하여 규조류 Chaetoceros spp. 적조의 방제기술 개발을 위한 목적의 일환으로 우리나라 연안에서 Chsetoceros calcitrans증식 저해균을 검색 분리하였으며 분리균의 세균학적 특성과 각종 규조류의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 1. C. calcitrans에 대해서 증식 저해활성이 간한 균을 검색$\cdot$분리한 결과 Alteromonas sp.로 동정되었으며, 이 균을 Alteromonas sp. SR-14로 명명하였다 2. Alteromonas sp. SR-14는 생해수, 숙성해수, 무기염 배지 및 미세조류 C. calcitrans 배양석액에서 증식할 수 있었다. 3. Alteromonas sp. SR-14는 C. calcitrans, C. muclleri 및 C. negracile 등에 대해서만 증식 저해활성이 있었다. 4. Alteromonas sp. SR-14에 의한 C. calcitrans의 사멸과정은 대부분의 경우 외형을 그대로 유지하면서 세포 내용물만 서서히 소실되었고, 부분적으로는 protoplast도 출현하였다가 용해되는 경우도 있었다.
Alteromonas sp. SR-14의 배양여액을 사용하여 C. calcitrans의 증식에 미치는 영향과 조류 증식저해 물질의 특성을 살펴보았다. Alteromonas sp. SR-14의 peptone broth 배양여액은 C. calcitrans에 대하여 증식 저해 활성을 나타내었으며, 이 균에 의한 조류 증식 저해 물질은 온도 $15~20^{\circ}C$, pH 7.0~9.0, 염분 농도 $23~30{\textperthousand}$의배양 조건에서 강한 활성으로 생성되었으며, 이러한 조건(온도 $20^{\circ}C$, pH 8.0, 염분 농도 $30\textperthousand$)에서는 정지기부터 활성이 증가하였다. Alteromonas sp. SR-14가 peptone broth에서 생산하는 조류 증식 저해 물질의 분자량은 약 3KDa~12KDa의 복합 물질이었는데, $100^{\circ}C$에서 10분간 열처리하였을 때 3~10KDa 이하의 물질은 내열성이 있었으나 10KDa 이상의 물질은 불활성 되었다.
A novel agar-degrading marine bacterium, SH-1 strain, was isolated from seashore of Namhae at Gyeongnam province, Korea. The SH-1 strain exhibited 98% similarity with Alteromonas species based on 16S rDNA sequencing and named as Alteromonas sp. SH-1. Alteromonas sp. SH-1 showed agarase activity of 348.3 U/L (1.67 U/mg protein). The molecular masses of the enzymes were predicted as about 85 kDa and 110 kDa by SDS-PAGE and zymogram. The enzymatic activity was optimal at $30^{\circ}C$ and the relative agarase activity was decreased as temperature increase from $30^{\circ}C$ and thus about 90% and 70% activities were shown at $40^{\circ}C$ and $50^{\circ}C$, respectively. The optimum pH was 6.0 for agarase activity in 20 mM Tris-HCl buffer and activities were less than 70% and 85% activity at pH 5.0 and pH 7.0, respectively, compared with that at pH 6. Agarase activity has remained over 90% at $20^{\circ}C$ after 1.5 hour exposure at this temperature. However, its activity was less than 60% at $30^{\circ}C$ after 0.5 h exposure at this temperature. The enzymes produced agarooligosaccharides such as agaropentaose and agarotriose from agarose, indicating that the agarases are ${\alpha}$-agarases. Thus, Alteromonas sp. SH-1 and its agarases would be useful for the industrial production of agarooligosaccharides which are known as having anticancer and antioxidation activities.
전자 공여능으로 항산화 물질 생산 능력이 우수한 해양 미생물을 분리하여 HJ-14라고 명명하였다. HJ-14는 형태적, 생리적, 생화학적 특성이 Altermonas macleodii ATCC 27126T와 가장 유사하였으며, 주요 세포 지방산이 $C_{14:0}$ , $C_{15:0}$ , $C_{16:1}$ 및 $C_{17:1}$$_{w8c}$로 분석됨으로서 Aiteromonas SP- HJ-14로 동정하였다. Alteromonas sp. HJ-l4의 항산화 물질 생산에 대한 배양 특성을 조사하기 위해, 탄소원, 무기질소원, sodium chloride농도, 초기 pH및 배양온도의 영향을 관찰하였다. 탄소원으로는 2.5% dextrin, 무기 질소원으로는 ammonium sulfate, sodium chloride는 2~6%, pH와 온도는 각각 pH 6~8, 25~37$^{\circ}C$에서 전자공여능이 높게 나타났으며, 최적 조건일 때에 전자공여능은 90~92%로.나타났다 또한, OH소거능도 90.03%로 관찰되어 항산화활성이 높은 것으로 확인되었다.
알칼리성 protease를 생산하는 균을 고추장에서 분리하여 Alteromonas sp. CN301로 동정하고 그 알칼리성 protease를 생산하여 정제효소의 성질을 조사한 결과, 최적 pH 12.0, 최적 온도 $35^{\circ}C$이었으며 pH 안정성은 $pH\;6.0{\sim}13.0$ 범위에서 80% 이상의 잔존효소 활성을 나타냈고 $50^{\circ}C$에서 1시간 처리로 64%의 활성을 보였다. SDS-PAGE에 의한 분자량은 31,000 dalton이었고 $Hg^{2+}$를 제외한 다른 금속이온에 대해서는 저해를 받지 않았다. 계면활성제인 Triton X-100, Tween 20과 80은 이 효소의 활성을 상승시키는 효과를 보였으며 EDTA와 PMSF에 의하여 효소활성이 저해되므로 효소분자 중에 금속이온을 가지는 serine protease로 생각되었다.
The agar-degrading bacterium GNUM-1 was isolated from the brown algal species Sargassum serratifolium, which was obtained from the West Sea of Korea, by using the selective artificial seawater agar plate. The cells were Gram-negative, $0.5-0.6{\mu}m$ wide and $2.0-2.5{\mu}m$ long curved rods with a single polar flagellum, forming nonpigmented, circular, smooth colonies. Cells grew at $20^{\circ}C-37^{\circ}C$, between pH 5.0 and 9.0, and at 1-10% (w/v) NaCl. The DNA G+C content of the GNUM-1 strain was 45.5 mol%. The 16S rRNA sequence of the GNUM-1 was very similar to those of Alteromonas stellipolaris LMG 21861 (99.86% sequence homology) and Alteromonas addita $R10SW13^T$(99.64% sequence homology), which led us to assign it to the genus Alteromonas. It showed positive activities for agarase, amylase, gelatinase, alkaline phosphatase, esterase (C8), lipase (C14), leucine arylamidase, valine arylamidase, ${\alpha}$-chymotrypsin, acid phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, ${\alpha}$-galactosidase, ${\beta}$-galactosidase, ${\beta}$-glucosidase, catalase, and urease. It can utilize citrate, malic acid, and trisodium citrate. The major fatty acids were summed feature 3 (21.5%, comprising $C_{16:1}{\omega}7c/iso-C_{15:0}$ 2-OH) and C16:0 (15.04%). On the basis of the variations in many biochemical characteristics, GNUM-1 was considered as unique and thus was named Alteromonas sp. GNUM-1. It produced the highest agarase activity in modified ASW medium containing 0.4% sucrose, but lower activity in rich media despite superior growth, implying that agarase production is tightly regulated and repressed in a rich nutrient condition. The 30 kDa protein with agarase activity was identified by zymography, and this report serves as the very first account of such a protein in the genus Alteromonas.
An esterase gene, estA1, was cloned from Alteromonas sp. 39-G1 isolated from the Beaufort Sea. The gene is composed of 1,140 nucleotides and codes for a 41,190 Da protein containing 379 amino acids. As a result of a BLAST search, the protein sequence of esterase EstA1 was found to be identical to Alteromonas sp. esterase (GenBank: PHS53692). As far as we know, no research on this enzyme has yet been conducted. Phylogenetic analysis showed that esterase EstA1 was a member of the bacterial lipolytic enzyme family IV (hormone sensitive lipases). Two deletion mutants (Δ20 and Δ54) of the esterase EstA1 were produced in Escherichia coli BL21 (DE3) cells with part of the N-terminal of the protein removed and His-tag attached to the C-terminal. These enzymes exhibited the highest activity toward p-nitrophenyl (pNP) acetate (C2) and had little or no activity towards pNP-esters with acyl chains longer than C6. Their optimum temperature and pH of the catalytic activity were 45℃ and pH 8.0, respectively. As the NaCl concentration increased, their enzyme activities continued to increase and the highest enzyme activities were measured in 5 M NaCl. These enzymes were found to be stable for up to 8 h in the concentration of 3-5 M NaCl. Moreover, they have been found to be stable for various metal ions, detergents and organic solvents. These salt-tolerant and chemical-resistant properties suggest that the enzyme esterase EstA1 is both academically and industrially useful.
미세조류 증식 저해균 Shewanella sp. SR-14와 연안해역에서 우점종으로 분포하는 세균인 Vibrio alginolyticus가 규조, Chaetoceros calcitrans의 증식에 미치는 영향 그리고 V. ajginolyticus가 Shewanella sp. SR-14의 C. calcitrans 증식저해 활성에 미치는 영향을 혼합배양으로 측정하였다. Shewsnella sp. SR-14와 해수에서 분리한 V. alginolyticus는 미세조류 배양용 무기배지에서 단독 또는 혼합 배양하여도 잘 증식하였으며, C. calcitrans와 혼합배양시 Shewanella sp. SR-14는 조류증식을 저해한 반면 V alginolyticus는 이 조류의 증식을 촉진하였다. 조류가 첨가된 배지에 Shewanella sp. SR-14의 최초 접종균수가 V. alginolyticus와 거의 같거나 1 log 정도 적게 접종되었을 때에는 C. calcitrans에 대한 Shewanella sp. SR-14의 증식 저해활성이 유지되었으나 V. alginolricus의 최초균수가 Shewanella sp. SR-14보다 3 log 이상 많았을 때에는 조류증식 저해활성이 나타나지 않았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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