Alcohol oxidase catalyzes the oxidation of short lines alcohol to aldehyde. In this study, alcohol oxidase from Hansenula polymorpha (HpAOD) was induced by addition of 0.5% methanol as the carbon source and purified to electrophoretic homogeneity by column chromatographies. The purified HpAOD was immobilized with DEAE-cellulose particles and its biochemical properties were compared with those of free enzyme. The substrate specificity and the optimum pH of immobilized enzyme were similar to those of free enzyme. On the other hand, the Km values of free and immobilized enzymes for ethanol were 6.66 and 14.65 mM, respectively. The optimum temperature for free enzyme was ${50^{\circ}C}$, whereas that for immobilized enzyme was ${65^{\circ}C}$. Immobilized enzyme showed high stability against long storage. Immobilized enzyme was also tested for the enzymatic determination of ethanol by the colorimetric method. We detected 1 mg/liter ethanol ($1{\times}10^{-4}$% ethanol) by 2,6- dichloroindophenol system. Therefore, the present study demonstrated that immobilized HpAOD has high substrate specificity toward ethanol and storage stability, which may be of considerable interest for alcohol biosensor and industrial application.
Alcohol oxidase와 alcohol dehydrogenase를 DEAE-Cellulose와 ePG에 고정화시켜 에탄올을 산 화시키는 반응을 기상에서 수행하였다. 이 기상반응 의 반응활성은 반응온도와 효소의 hydration 정도에 큰 영향을 받았다. 온도에 의한 효소활성의 변화는 액상에셔의 경우와 비슷한 경향을 보였다. 즉 기상 반응에서도 $35^{\circ}C$에서 $40^{\circ}C$ 사이에서 최고의 활성을 나타내였다. 효소의 hydration 정도는 효소의 활성 에 매우 큰 영향을 끼치는 인자였는데 water activity가 0.8 정도까지는 water activIty가 증가함 에 따라 효소의 활성이 급격히 증가하다가 그 이상 에서는 다소 감소하는 경향을 보였다. 쇼소의 얀정 성도 water activity에 의해서 크게 영향을 받았는데 water actIvity가 0.5 정도까지는 water activity가 증가함에 따라 안정성이 비교적 급격히 감소하였고 그 이상의 water activity에서는 효소의 안정성이 water activity의 영향을 크게 받지 않고 어느 정도 엘정하게 유지되었다. 담체의 흡착성능이 기상반응에 마치는 영향을 알아보가 위하여 셔로 흡 착성능이 다른 DEAE-Cellulose와 CPG에 고정화 된 효소를 사용하여 반응을 비교해 본 결과 담체의 흡착성능은 반응에 별 영향을 주지 못했다. Alcoh이 O oxidase의 기상반응 속도상수(Km=0.24mM)는 액상에서의 값(Km=11.22mM)과 order of magni tude가 약 2 정도의 차이를 보여주었는데 이는 기질 인 에탄올의 기 액 평형상태에셔의 각상간의 농도의 order of magnitude 차와 비슷하였다. 같은 산화효 소류이나 조효소를 펠요로 하고 반응속도식이 많이 다른 alcohol dehydrogenase 효소에도, 기상반응 속도상수와 사용기질의 기 액평형 데이타와의 이와 같은 연관성이 성립하였다. 이같은 연관성이 산화환 원효소류가 아닌 다른 효소류에도 적용될지의 여부는 앞으로의 연구로 밝혀야 할 것이다.
The influence of Panax ginseng on alcohol-induced hyperuricemia were observed. Changes of uric acid blood levels and hepatic xanthine oxidase activities were studied by means of treating alcohol intoxication with ginseng. It was found that a single dose (4 mg/Kg) of ginseng saponin administered intraperitoneally significantly inhibits the hepatic xanthine oxidase activities and decrease urate blood levels in ethanol-induced hyperuricemic mice. It was also observed that there were some difference in pharmacological aspect between Panax ginseng and allopurinol which is a potent inhibitor of xanthine oxidase from any sources.
생물학적 난분해성 물질인 폴리비닐 알콜(PVA : Polyvinyl alcohol)을 탄소원 및 에너지원으로 이용하는 Xanthomonas campestris J2Y로부터 PVA oxidase를 생산하여 정제하기 위하여 PVA가 탄소원으로 첨가된 배지에서 진탕배양한 배양액을 원심분리한 후 상등액을 10 mM phosphate buffer(pH 7.5)로 평형시킨 DEAE -cellulose를 통과시켜 얻은 분획을 사용하여 DEAE-cellulose와 Sephadex G-150을 이용한 Gel filtration을 통하여 PVA oxidase를 정제하였다. 정제된 PVA oxidase는 polyacrylamide gel 전기영동으로 단일밴드로 확인되었으며 SDS-polyacrylamide gel 전기영동과 Sephadex G-150 column chromatography를 통해 측정한 결과 55,000 daltons 이었다. PVA oxidase의 최적 pH는 7이고 최적온도는 $37^{\circ}C$였다. 열 안정성은 $50^{\circ}C$까지는 70% 이상의 안정성을 나타내었고, pH에 대한 안정성은 5-11에서 비교적 안정하였다. 금속이온에 대한 영향은 $Ag^{2+},\;Hg^{2+},\;Sn^{2+}$ 등에서는 아주 강한 저해를 받았고, $Co^{2+},\;Fe^{2+},\;Zn^{2+},\;Pb^{2+}$에서는 50% 정도의 저해를 받았다. 반면에 $Mn^{2+},\;Cu^{2+}$는 효소활성을 증가시켰다. PVA에 정제 PVA oxidase의 Km치는 $7.04{\times}10\;^2mmol/{\ell}$이었다.
효모 Hansenula polymorpha 로부터 탄소원으로 0.5% 메탄올을 이용하여 알코올 산화효소를 대량 유도 발현하였다. 발현 유도된 Hansenula polymorpha 알코올 산화효소는 두 단계의 컬럼 크로마토그래피를 통하여 전기영동에서 단일밴드로 정제하였다. 정제한 효소는 주로 일차 지방족 알코올을 산화시키며, 에탄올에 대해 가장 높은 기질특이성을 보였다. 이 효소가 촉매하는 에탄올 산화반응의 최적 pH는 8.5 이였으며, 최적 온도는 $50^{\circ}C$를 나타내었다. 효소의 $T_m$ 값은 약 $52^{\circ}C$ 이었으며, $65^{\circ}C$에서도 완전히 불활성화 되지 않았다. 또한 효소는 변성제와 7주간의 비교적 장기간 보전에 대해서도 안정하였다. 이 효소는 알코올 측정을 위한 효소학적 방법 및 알코올과 알데히드의 공업적 생산에 이용될 수 있다.
전기자극에서 알콜 산화효소의 활성도와 안정도를 연구하였다. 알콜 산화효소의 활성도와 안정도는 전기출력전압, 자극시간, 자극기간, 자극간격에 따라 달라진다. 전기자극에 의하여 비활성화 효소 활성도는 당, 중합체, 히드로젤과 같은 안정화 첨가제에 의하여 회복되었다. 이 효소에 전기자극을 40 V, 10분 주었을 때 완충용액에서는 활성도가 전혀 없었지만 10% 트레할로스 용액에서는 52%의 활성도를 유지하였다. 전기자극하에서 효소를 안정화시킬 수 있음은 효소를 생물공학과 의료공학에 널리 이용할 수 있는 가능성을 보여준다.
Alcohol and acetaldehyde concentrations were measured in the blood and brain of rats which were treated with 20% alcohol (control group) or co-administered 20% alcohol with ginseng extract residue roasted (test group). There was no change in blood alcohol concentration between control and test group. However, the brain alcohol concentration was lowered in the test group which was treated for seven days. The concentration of aldehyde in the brain and blood was lowered in the test group. The activities of monoamine oxidase b in various regions of brain were recovered to normal group in the test groups. However, the Quantities of naloxone binding receptors were not changed by ginseng extract residue roasted.
Enzyme multilayers composed of avidin and biotin-labeled enzymes were prepared on the surface of electrode, through a strong affinity between avidin and biotin (binding constant: ca $10^{15} M^{-1}$). The enzyme multilayers were useful for the improvement of the performance characteristies of enzyme sensors. The output current of the enzyme sensors depended linearly on the number of enzyme layers deposited. Thus, lactate oxidase (LOx) and alcohol oxidase (AlOx) were deposited after being modified with biotin for constructing enzyme sensors sensitive to L-lactate and ethanol respectively. It was also possible to deposit two different kinds of enzymes successively in a single multilayer. The glucose oxidase (GOx) and ascorbate oxidase (AsOx) were built into a multilayer structure on a Platinum electrode. The GOx, AsOx multilayer-modified electrode was useful for the elimination of ascorbic acid interference of the glucose sensor.
The present study was undertaken to investigate the effect of the water extract of the puffer fish Fugu xanthopterus(FXH) on the alcohol induced hyperuricemia. The normal group and the FXH treated group showed no sigbificant changes in the levels of blood uric acid but, the blood uric acid significantly decreased in the FXh treated rats with 100mg/kg for two weeks compared to the ethanol treated group. There were no significant changes in the activities of uricase, adenosine deaminase, guanine deaminase, and purine uncleoside phosphorylase, among all the test group. But the activitis of liver xanthine oxidase were recovered to the normal level in ethanol +FXH treated group comparing to the ethanol treated group. Furthermore, ethanol+FXH treated rats showed the similar pattern in the levels of blood uric acid and urinary allantoin with normal group. These results indicate that the decreased blood uric acid by the FXH treatment of the alcohol induced hyperuricemia rats may result from decreased activity of hepatic xanthine oxidase.
노화현상에 따른 여러 가지 병태생리조건의 형성과 난치성 성인병질환의 발병 및 진행과정에 활성산소류들과 이들에 의해 유도되어지는 free radical이 관여하고 있다는 증거가 여러연구진에 의해서 보고되어지고 있다. 산소를 이용하여 생명현상을 이어가는 생물체들은 필연적으로 활성산소들을 생성하는 생화학적 산화반응기구를 효율적으로 활용하면서 항상성을 유지시키고 있다. 그러므로 활성산소의 생성과 분해과정의 평형유지는 생물학적으로 대단히 중요한 의미를 갖고 있다. 임상적으로 alcohol은 질병의 악화 내지는 질환의 발병조건을 조성하는 병태생리기구에 기여할 것으로 생각되어 대부분의 환자에게 금주시키고 있으나 그 작용기전에 대해서는 충분히 설명되지 못하고 있다. 본 연구에서는 alcohol을 급ㆍ만성으로 실험동물에 투여하고 생체에서 활성산소 생성에 중요한 역할을 하는 xanthine oxidase와 aldehyde oxidase의 활성변화를 관찰하면서 전자의 형전환속도와 과산화지질 생성속도와의 상관성을 중점 비교 관찰하므로서 alcohol성 간손상 실험 model을 계획하였다. 간 및 신장조직에서 alcohol에 유래되는 활성산소의 생성계에 관여하는 효소 활성의 변화와 조직의 과산화지질 생성반응 속도는 alcohol의 투여방법, 기간, 시간(diurnal variation), 나이 및 암수에 따라 다르게 나타남을 관찰할 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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