• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권1호
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• pp.17-25
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• 2013

메탄올 자화효모 Hansenula polymorpha에서 분비 발현이 잘 된다고 보고된 인체 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)을 융합단편으로 사용하여 외래 재조합 단백질을 효과적으로 분비 발현할 수 있는 발현시스템을 개발하고자 하였다. 이때 조작의 용이성 및 발현 효율 제고를 위하여 전장의 HSA 뿐만 아니라 세 종류의 각기 다른 크기의 HSA 단편을 설계하여 융합단편으로 사용하였다. 즉 HSA의 N-말단으로 부터 각기 137, 172, 320, 608개 아미노산을 갖는 융합단편 HSAft (1-4)를 제작하였다. 아울러 발현되는 HSA 단편의 검출 및 분리정제를 위한 His8-tag, HSA 융합단편과 외래 단백질간의 유연성을 부여하기 위한 2조의 $Gly_4Ser_1$ linker, 융합 발현된 타겟 단백질을 HSA 단편으로부터 용이하게 분리하기 위한 담배식각바이러스 단백질분해효소(tobacco etch virus protease, Tev) 인지 서열, 타겟 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 멀티 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS)서열, 그리고 타겟 재조합 단백질의 발현 검출 및 정제를 위한 Strep-tag을 포함하는 작용기 도메인을 발현카세트 기본 골격에 포함시켰다. 이렇게 구축된 4종의 HSA 융합단편 분비발현 벡터를 H. polymorpha에 형질전환한 후 각 융합단편의 발현을 조사한 결과 HSAft 단편 3, 4의 발현을 확인할 수 있었다. 녹색형광단백질 유전자 ($GFP_{uv}$)를 상기 벡터에 클로닝한 후 H. polymorpha에 도입한 결과 형질 전환체 모두에서 녹색형광단백질의 발현을 관찰 할 수 있었다. 해당 세포로부터 분비되거나 세포내에 발현되는 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현양을 비교한 결과 HSAft 단편 4에 융합된 경우를 제외하고 나머지 경우 모두에서 세포 파쇄액과 세포 배양액 양쪽에서 해당 HSA 단편 융합 형광단백질의 발현을 확인 할 수 있었다. 한편 HSA 융합단편의 크기에 따라 자체 혹은 타겟 단백질과 융합된 형태의 단백질 분비 발현 정도가 달라지는 것은 해당 단백질의 접힘이나 단백질 분해효소에 대한 민감성 등 여러 변수에 의한 것으로 사료되며 따라서 본 연구에서 개발한 H. polymorpha용 HSA 융합단편 분비발현 시스템은 특정 외래 재조합 단백질의 효율적인 분비발현 융합단편의 선별 및 과발현 시스템 구축에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권2호
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• pp.119-124
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• 2001

본 연구는 한우 난포발달에 있어서 난포액 및 inhibin의 생리적 역할을 검토하기 위해 수행되었다. Anti-inhibin serum(AI)생산을 위해 사용된 항원은 porcine inhibin-$\alpha$-subunit 19~32의 peptide를 사용하여 adjuvant 용액을 혼합, 앙고라종 토끼 5두(체중 2.5kg)에게 주 2회 간격으로 면역 실시 후 52일째의 토끼로부터 항혈청을 생산하였다. 과립막 세포의 체외배양을 위해 D-MEM(10% FCS와 antibiotics를 첨가)을 배양액으로 하여 1$\times$$10^{6}$ cells/$m\ell$로 조절하였으며, 호르몬은 RIA 및 ELISA법으로 분석하였다. Western blotting법에 의해 과립막 세포 및 황체조직의 각 세포질을 SDS-PAGE로 분리하여 nitro cellulose membrane에 transfer하여 검토한 결과, 직경 1.0 cm의 성숙 난포의 granulosa cell의 세포질에서 특이하게 Inhibin이 존재하고 있음이 확인되었으나, 황체조직 및 성숙 난포에서는 검출되지 않았다. 난포 크기별 난포액의 progesterone 및 estradiol-17$\beta$을 농도를 분석한 결과, estradiol-17$\beta$농도는 난포 크기가 직경 2.0 cm부터 유의적으로 높았으나 난포 크기가 적을수록 감소되었다. 이에 반해, Progesterone 농도는 직경 2.0 cm 난포에서 가장 높았으며 난포 크기가 적을수록 낮았다. 과립막 세포의 48시간 체외배양에서 bFF 5% 처리구와 bFF 5%+AI 5% 처리구에서는 progesterone은 대조구보다 유의적으로 억제되었으나, AI 5% 단독 처리구에서는 대조구와 큰 차이가 없었다. 또한, estradiol-17$\beta$농도는 5% AI구와 5% AI+5% bFF 처리구에서는 대조구에 비해 증가하였다. 그러나, 5% bFF 단독처리구에서는 대조구와 큰 차이가 없었다. 이상의 결과로, 한우에 있어서 성숙난포에 존재하는 Inhibin은 AI처리에 의해 내인성 Inhibin의 기능이 약하되어 FSH분비를 조절하는 역할을 함으로써 난포발달 및 난포세포의 스테로이드호르몬합성에 중요하게 관여하고 있는 것으로 사료된다.

• 폴리머
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• 제32권2호
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• pp.131-137
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• 2008

전기방사법에 의해 폴리스테렌 나노섬유 부직포를 제조하였고, 간세포의 접착을 유도하기 위해 간세포접착 리간드인 Poly[N-p-vinylbenzyl-O-$\beta$-D-galactopyranocyl-($1{\rightarrow}4$)-D-gluconamide](PVLA)를 나노섬유의 표면에 코팅하였다. 얻어진 나노섬유는 평균직경이 500 nm이었고 분광학적인 방법을 통해 PS 나노섬유 표면의 개질 여부를 확인하였다. 장기간 배양시의 간세포 생존율을 MTT법으로 조사한 결과 기존의 세포배양접시에서는 급격하게 세포생존율이 감소함에 비해 PVLA가 코팅된 나노섬유상에서는 생존율이 서서히 감소하였으며 약 3주간에 걸쳐 간세포가 생존율이 유지되었다. 간세포의 대표적인 기능인 알부민분비 및 요소분해능을 측정한 결과 기존의 세포배양접시에서는 급격하게 간세포기능이 저하되었지만, PVLA가 코팅된 나노섬유상에서는 약 3주정도 초기의 간세포기능을 유지하는 것이 밝혀졌다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제32권4호
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• pp.586-590
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• 2003

사람 간 배양세포 유래 HePG2 세포에 영양성분을 이용하여 실험적으로 중성지질을 축적시킨 상태에서 한방 황련해독탕(HT)의 약리적 효과를 검토하였다. 간세포는 1 mM oleate, 0.2% BSA, glucose 4.5 mg/mL 및 HT 무첨가(대조구) 또는 첨가한(0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지에서 6시간 및 24시간 배양하였으며(실험 I), 이때 황련해독탕을 첨가한 배양액에는 ［$^{14}$ C］-oleate (0.5 $\mu$Ci/mL medium)를 동시에 첨가하여 중성지질 획분에의 동위원소 추적실험을 하였다. 또한, 간세포에 2 mM oleate, 0.5% BSA, glucose 4.2mg/mL 및 HT 무첨가(대조구) 또는 첨가한(0.5 mg/mL 및 5.0 mg/mL) DME배지에서 6, 24및 48시간 배양(실험 II) 또는 1 및 3시간 배양(실험 III)하였다. 실험 I에서 세포내 중성지질 농도는 HT첨가 6 및 24시간 배양에서 약물농도첨가 의존적으로 감소하였다. 이때 HT첨가시 ［$^{14}$ C］-oleate 동위원소는 세포내 중성지질 획분의 추적량과 세포외 분비량이 현저하게 감소하였다. 실험 I조건에 비해 고농도의 영양성분을 첨가시킨 실험 II 및 III 조건에서 세포내 중성지질 축적이 확인되었으며, 이 때 HT 첨가 24 및 48시간 배양에서는 세포내 중성지질 축적이 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서, 본 실험에 사용된 한방 황련해독탕은 사람 간배 양 HePG2 세포내 중성 지질 합성을 저하시켜 중성지질 축적을 억제시킴으로써 지방간 개선효과를 발휘한 것으로 시사되었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제56권5호
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• pp.409-418
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• 2018

Acanthamoeba spp. are free-living protozoa that are opportunistic pathogens for humans. Cysteine proteases of Acanthamoeba have been partially characterized, but their biochemical and functional properties are not clearly understood yet. In this study, we isolated a gene encoding cysteine protease of A. castellanii (AcCP) and its biochemical and functional properties were analyzed. Sequence analysis of AcCP suggests that this enzyme is a typical cathepsin L family cysteine protease, which shares similar structural characteristics with other cathepsin L-like enzymes. The recombinant AcCP showed enzymatic activity in acidic conditions with an optimum at pH 4.0. The recombinant enzyme effectively hydrolyzed human proteins including hemoglobin, albumin, immunoglobuins A and G, and fibronectin at acidic pH. AcCP mainly localized in lysosomal compartment and its expression was observed in both trophozoites and cysts. AcCP was also identified in cultured medium of A. castellanii. Considering to lysosomal localization, secretion or release by trophozoites and continuous expression in trophozoites and cysts, the enzyme could be a multifunctional enzyme that plays important biological functions for nutrition, development and pathogenicity of A. castellanii. These results also imply that AcCP can be a promising target for development of chemotherapeutic drug for Acanthamoeba infections.

• KSBB Journal
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• 제29권1호
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• pp.58-66
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• 2014

Demand for in vitro pharmacological evaluation and toxicity test using human hepatocytes has been increasing. In USA and Europe, human hepatocytes obtained from donated whole liver unsuitable for transplantation were distributed to researchers and deposited in cell bank facility as cryopreserved vial. In Korea, however, incidence of transplantation- inappropriate whole liver has been quite low and the whole livers almost have so severe liver disease such as fatty or fibrotic liver that cannot meet the demand. In this study we aimed to isolate human hepatocytes from liver resection surgery-originated partial liver, and assure the isolated human hepatocytes and its cryopreserved hepatocytes to be qualified for the in vitro pharmacological evaluation and drug toxicity tests. We compared those with commercially available human hepatocyte, BD $GenTest^{TM}$ by cell morphology, hepatic gene expression, urea synthesis, albumin secretion, ammonia removal, and cytochrome P450 induction activities. Changes in hepatotoxic gene expression after cryopreservation are evaluated with a typical hepatotoxic drug, acetaminophen. Consequently, the fresh hepatocytes from the partial liver and its cryopreserved hepatocytes expressed their intrinsic hepatic functions well and showed equal hepatotoxicity gene expression trend regardless to cryopreservation. Therefore, liver resection surgery-originated partial liver can be used as a useful source of human hepatocytes for various pharmacological and hepatotoxicity test.

• Applied Microscopy
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• 제31권1호
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• pp.19-35
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• 2001

계절성 번식기 동안에 자성무지개송어 (Oncorhynchus mykiss)의 혈장내 $estradiol-17\beta$, 혈장성분, 전기영동상 그리고 미세구조 변화의 특징을 살펴보았다. 정상적인 자연조건에서 혈장내 $estradiol-17\beta$는 난황형성기(vitellogenic season)말인 9월에 peak를 나타내었고, 산란이 이루어진 시기 이후인 12월에는 서서히 감소하였으며, 난소의 재형성 초기인 2월과 3월에는 급격하게 감소하였다. 이러한 $estradiol-17\beta$의 변화 추이를 볼 때 이 호르몬은 자성 무지개송어에서 혈장내 calcium, phosphorus, glucose, albumin및 total protein수준의 증가에 의해서 증명된 것과 같이 난황전구물질(vitellogenin)의 생성을 자극하는 것으로 나타났다. Latematuring단계 혹은 산란중인 난모세포의 전기영동상(분자량이 각각 약 70,000과 200,000 Da)은 late perinucleolus단계의 난모세포의 전기명동상보다 훨씬 두껍고 진한 경향을 나타내었다. 이 단백질 2개의 전기영동상은 $estradiol-17\beta$ 호르몬 peak와 일치하는 추이를 나타내면서 SDS-PAGE에서 확인되었다. 생식소 숙도지수 일명 성성숙지수, [gonadosomatic indices(GSI)]는 10월로부터 그 이듬해 1월까지 유의성 있게 증가하는 경향을 나타내었고, 성숙난자의 급격한 수적인 증가와 일치하면서 1월에 가장 높은 peak를 나타내었다. 산란 전단계에서 estradiol-17 수준과 CSI간에는 정 (+)의 상관관계 (r=0.701, p<0.01)를 나타내었고, 간숙도지수 [hepatosomatic index (HSI)]는 번식시기인 12월에 가장 높은 수치를 나타내었다. 번식시기 (12월)에 생식소 자극호르몬 분비세포(gonadotropes)는 granules와 globules와 같은 생식소자극호르몬을 포함한 봉입체로 가득찬 상태를 나타내었다. 난황형성기에는 late perinucleolus 난모세포가 난황의 축적을 통해서 early maturing난모세포로 변형되는 과정이며, 이 시기의 난모세포는 late maturing단계로 되면서 난황으로 완전히 가득찬 상태로 확인되었다. 핵이주 단계에 있는 난모세포의 과립막세포의 미세구조를 살펴보면 팽창된 조면 내형질세망과 tubular cristae가 있는 간상의 미토콘드리아로 구성되어 있었다. 방사대 (zona radials)와 난황막 사이에 있는 미세융모(finger-like projections)는 각각 성장하면서 난황형성기에 pore canals을 이루면서 서로 연결되나, 난성숙기에 방사대가 더욱더 치밀하게 되면 수축되어 봉쇄되면서 위축되는 것으로 확인되었다. 방사대는 외측에 않은 homogeneous layer와 내측에 2개의 두꺼운 helicoidal layers (zona radiata interna and zona radials externa)총 3개의 구조물로 구성되어 있었다. 정상적인 환경조건에서 볼 때 난포는 난형성과 생식소에서 분비되는 스테로이드 흐르몬의 생성에 충분할 만큼 조직의 발달과 호르몬의 주기적인 분비에 영향을 주는 것으로 나타났다.

• 한국식품과학회지
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• 제42권2호
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• pp.204-209
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• 2010

STZ으로 당뇨를 유발 8주 후 당뇨대조군은 공복혈당이 $451{\pm}42.6\;mg/dL$인데 비해 Kocat-D1-1(Kocat-D1 추출물을 0.25 g/kg/day 투여한 군)에서는 $334.3{\pm}32.9\;mg/dL$, Kocat-D1-2(Kocat-D1 추출물을 1 g/kg/day 투여한 군)에서는 $259.5{\pm}35.0\;mg/dL$로 투여 농도에 의존적으로 당뇨대조군에 비해 유의적 수준으로 혈당이 낮아졌다. OGTT 검사에서도 180분 경과 후에도 당뇨대조군은 포도당 투여전보다 혈당이 $55.5{\pm}5.1\;mg/dL$ 높았으나 Kocat-D1-2는 $17.0{\pm}7.4\;mg/dL$로 유의적으로 낮아졌다. STZ에 의해 유도된 당뇨쥐는 정상대조군에 비해 혈장내의 GOT($411.3{\pm}31.3\;U/L$), GPT($162.3{\pm}23.2\;U/L$) 모두 현저히 증가하였다. 이에 비해 Kocat-D1-2 군에서는 GOT($247.0{\pm}33.4\;U/L$), GPT($116.3{\pm}17.4\;U/L$) 모두 유의적인 수준으로 당뇨대조군에 비해 감소하였다. 알부민 수치 또한 정상대조군 $3.9{\pm}0.1\;U/L$에 비해 당뇨대조군은 $2.7{\pm}0.3\;U/L$으로 낮아졌으나 Kocat-D1-2군에서는 $3.0{\pm}0.1\;U/L$로 증가하였다. HDL-콜레스테롤 수치 또한 정상대조군이 $26.8{\pm}3.9\;mg/dL$인데 비해 당뇨대조군은 $11.7{\pm}1.3\;mg/dL$로 낮아졌다. 그러나 Kocat-D1을 투여한 두 군 모두 각각 $22.3{\pm}2.0$, $26.8{\pm}1.2\;mg/dL$로 유의적인 수준으로 증가하였다. 간조직의 조직학적 관찰에서도 당뇨대조군의 경우 간세포사이에 지방구가 관찰되었으나, Kocat-D1-2는 거의 정상대조군과 유사하였으며 지방구를 관찰 할 수 없었다. 각 실험군의 혈액 중 인슐린 농도를 측정한 결과 정상대조군 $0.18{\pm}0.02\;ng/mL$인데 비해 당뇨대조군은 $0.05{\pm}0.04\;ng/mL$로 낮아졌으나 Kocat-D1-1은 $0.11{\pm}0.05$, Kocat-D1-2는 $0.13{\pm}0.02\;ng/mL$로 증가하였다. 췌장의 베타세포의 상대적 용적을 측정한 결과 Kocat-D1-2 군은 당뇨대조군의 $12.9{\pm}7.9%$에 비해 $49.4{\pm}4.2%$로 유의적인 수준으로 증가하였다. Kocat-D1-1군에서도 당뇨대조군보다 증가하는 경향은 보였으나 유의적인 차이는 없었다. Kocat-D1은 인슐린을 분비를 촉진시켜 혈당을 강하시키는 항당뇨효과를 가지고 있음을 알 수 있었다. 따라서 아직 명확한 학명 규명이 규명되지는 않았지만 Kocat-D1은 의약품 소재 및 기능성 식품 소재로서의 활용가능성이 있음을 본 연구를 통해 확인하였다.