• Biomolecules & Therapeutics
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• 제18권2호
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• pp.152-158
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• 2010

Melanin concentrating hormone is a neuropeptide highly expressed in the brain that regulates several physiological functions mediated by receptors in the G-protein coupled receptor family, especially plays an important role in the complex regulation of energy balance and body weight mediated by the melanin concentrating hormone receptor subtype 1 (MCH1). Compelling pharmacological evidence implicating MCH1 signaling in the regulation of food intake and energy expenditure has generated a great deal of interest by pharmaceutical companies as MCH1 antagonists may have potential therapeutic benefit in the treatment of obesity and metabolic syndrome. Although fluorescence-based calcium mobilization assay platform has been one of the most widely accepted tools for receptor research and drug discovery, fluorescence interference and shallow assay window limit their application in high throughput screening and have led to a growing interest in alternative, luminescence-based technologies. Herein, a luminescence-based functional assay system for the MCH1 receptor was developed and validated with the mitochondrial targeted aequorin. Aequorin based functional assay system for MCH1 presented excellent Z' factor (0.8983) and high signal-to-noise ratio (141.9). The nonpeptide MCH1 receptor antagonist, SNAP 7941 and GSK 803430, exhibited $IC_{50}$ values of 0.62 ${\pm}$ 0.11 and 12.29 ${\pm}$ 2.31 nM with excellent correlation coefficient. These results suggest that the aequorin based assay system for MCH1 is a strong alternative to the traditional GPCR related tools such as radioligand binding experiments and fluorescence functional determinations for the compound screening and receptor research.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제24권1호
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• pp.70-74
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• 2003

The heterogeneous bioluminescence immunoassay for digoxin was developed using photoprotein, native aequorin as a label and the site-directed immobilization technique based on avidin/biotin interaction. Aequorin is a bioluminescence protein, originally isolated from the jellyfish Aequoria Victoria and an attractive label in analytical applications because of sensitive detection due to virtually no background bioluminescent signal. Digoxin is a cardioactive drug, and its therapeutic level in serum is at low concentration with very narrow therapeutic index. The aequorin-digoxigenin conjugates were synthesized by the N-hydroxysuccinimide ester method and characterized in terms of bioluminescent residual activity. The resulting dose-response curve shows that the detection limit is $1.0\;{\times}\;10^{-10}\;M$ and a dynamic range is three orders of magnitude, which was obtained by $1.0\;{times}\;10^{-10}\;M$ conjugate and 0.9 μg/mL anti-digoxin antibody. Three structurally similar molecules to digoxin were examined for their cross-reactivity. None of these three compounds showed any crossreactivity with digoxin antibody employed in this study. Standard amounts of digoxin corresponding to the therapeutic range were spiked into the each serum solution. Study of the serum matrix effect indicated that correlation coefficient shows good agreement between luminescence light intensity between in buffer and in serum.

• 분석과학
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• 제23권1호
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• pp.60-67
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• 2010

본 연구는 생물발광단백질인 aequorin을 표지물질로 사용해 신경전달물질인 serotonin에 대한 생물 발광면역분석법을 처음으로 개발하였다: serotonin-avidin 접합체는 Mannich 법으로 합성하였으며, 최적화된 avidin: formaldehyde: serotonin의 초기 몰 비는 1:12,000:25 이었다. 개발된 serotonin에 대한 생물발광면 역분석법은 좋은 감도(LOD of 0.68 ng/mL)와 넓은 검출 범위($5.0{\times}10^{-10}\;M\sim5.0{\times}10^{-7}\;M$)를 나타내었다(참고, 혈청 내 serotonin의 양은 $151{\pm}45\;ng$/mL 이다.). 교차반응성에 대한 연구 결과, 5-methoxytryptamine은 28.0% 의 교차반응성을 보인 반면, 3-methylindole, melatonin 그리고 5-hydroxylindole-3-acetic acid 은 교차반응성을 보이지 않았다. 또한, 혈청에서의 회수율은 만족할만한 값이 얻어졌다. 그러므로, 본 연구에서 제안된 생물발광면역분석법은 혈청 내의 serotonin 을 모니터링 하는데 좋은 분석법으로 사용될 수 있다.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제27권3호
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• pp.407-412
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• 2006

Bioluminescence single-site immunometric assay for methamphetamine (MA) using the native aequorin, a photoprotein, as a signal generator was developed for the first time. MA is a potent sympathomimetic amine with stimulant effects on the central nervous system. MA abuse induces hallucinations and, thus, may cause a serious social problem. The single-site immunometric MA assay was optimized and its dose-response behavior was examined. The dose-response curve shows that the detection limit is 1.1 ${\times}$ $10^{-10}$ M and a dynamic range is four orders of magnitude with 15 $\mu$g/mL BSA-MA conjugate and 1.0 ${\times}$ $10^{-8}$ M anti-MA antibody-biotin conjugate. In order to evaluate this assay, the structurally similar compounds, amphetamine, ephedrine, norephedrine, benzphetamine and N-4-(aminobutyl)methamphetamine were examined for their crossreactivity. None of these five compounds showed any cross-reactivity. Additionally, an artificial urine solution spiked with MA was analyzed by the MA assay, and the result of the analysis demonstrated the usefulness of the present assay for the determination of MA in urine.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제17권11호
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• pp.640-647
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• 2016

형광 간섭 현상을 최소화시켜 상대적으로 민감한 측정이 가능한 aequorin기반 luminescence기술은 $G_{{\alpha}16}$ 단백질 도입을 통해 세포 내부의 칼슘 이동 신호를 감지하여 G 단백질 결합 수용체(G protein-coupled receptor, GPCR)의 기능 분석을 가능하게 하는 세포 기반 분석 기술로 수용체 및 G 단백질 유전자 전달의 최적화 과정이 필수적이다. 본 연구를 위해 corticotropin releasing factor receptor subtype 2(CRF2) 수용체를 모델 시스템으로 CRF2와 $G_{{\alpha}16}$ 단백질이 구축된 세 가지 안정화 세포주를 제작하였고, 이들을 이용한 서로 다른 세 가지 조건의 임시 발현 세포주에서 작용제(sauvagine)와 길항제(K41498)의 반응성을 분석하여 최적의 유전자 전달 방법을 도출하고자 하였다. 그 결과 sauvagine 및 K41498의 농도에 따른 반응에서 CRF2-$G_{{\alpha}16}$ 안정화 세포주가 임시 발현 세포주보다 10배 이상의 유효신호 비율을 나타내었고(z'=0.77) 임시 발현 세포주의 경우 $G_{{\alpha}16}$의 안정화 발현 이후에 CRF2를 전달하는 경우가 다른 임시 발현 조건보다 2배 이상 높은 효율을 보였다(z'=0.84). 따라서 임시 유전자 전달 기술을 GPCR 세포 기능 분석 시스템에 활용할 경우 $G_{{\alpha}16}$ 단백질에 대한 안정화 세포주를 우선적으로 구축하고, 목표하는 다양한 수용체들을 단계적으로 발현시키는 것이 최선의 방법이라 판단된다.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제16권11호
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• pp.7575-7581
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• 2015

corticotropin releasing factor(CRF)는 스트레스에 의해 유도되는 신경펩타이드 물질들 중 하나로서 모발의 손실 및 재성장에 영향을 미친다고 광범위하게 제기되어 왔다. 이에 CRF1 수용체 길항제 개발을 위하여 세포 내 칼슘 신호전달 기전을 이용한 스크리닝 시스템을 개발하고 최적화 연구를 수행하고자 하였다. 이를 위하여 에쿼린 모체세포에 CRF1 수용체와 만능 G 단백질인 G${\alpha}$16 유전자를 동시에 발현시켜 안정화 세포주를 구축하였다(HEK293a16/hCRF1). 표준 효현제인 sauvagine의 반응이 임시 발현세포와 비교하여 안정화 세포주에서 농도 의존적 반응 범위가 12배 이상 증가하였으며($EC_{50}:15.21{\pm}1.83nM$), 이에 따라 길항제 스크리닝에 필수적인 안정적인 신호와 높은 용매 허용도를 확보할 수 있었다. CRF1 수용체에 대한 표준 길항제인 antalarmin과 CP154526에 대한 $IC_{50}$ 수치는 각각 $414.1{\pm}5.5$와 $290.7{\pm}1.9nM$로 확인되었는데 냉동보관세포의 경우에도 유사한 결과를 얻었다. 에쿼린 기반 세포 기능실험의 최적화 연구를 통해 구축된 CRF 수용체 안정화 세포주는 모발의 재형성과 관련된 신규의 기능성 화장품 및 조절물질 개발 연구에 적극적으로 활용 가능 할 것으로 판단된다.

• Natural Product Sciences
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• 제20권4호
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• pp.281-284
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• 2014

In this study, twenty-one oleanane-type triterpenoid saponins were isolated from a methanol extract of the roots of Pulsatilla koreana. Antagonistic activities were measured in these compounds by the aequorin based cellular functional assay system for the corticotropin releasing factor receptor (CRF1). Of them, compounds 7 - 10 showed the highest degree of CRF1 inhibition further at the concentration of $10{\mu}M$. Moreover, by the analysis based on the structure-activity relationship of isolated saponins, a sugar chain at C-3 and a carboxyl group at C-28, as well as a methyl group at C-23 seems to be key functional elements. To our knowledge, this is the first report on CRF1 inhibition of saponins from P. koreana.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1992년도 제1회 신약개발 연구발표회 초록집
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• pp.33-33
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• 1992

항혈전성 약물로서 그의 항 혈소판 작용력은 dipyridamole보다 강하나 심혈관계 등에 대한 부작용이 적어 clinical efficiency가 유의하게 높은 약물개발에 대한 연구는 임상적 응용성 뿐 아니라, 혈소판-응고기전의 규명에 기여할 것으로 사료되는 바 본 연구에서는 cyclic nucleotide phosphodiesterase(PDE-I)들의 항혈소판 작용을 검토하여 그들의 혈관 내피세포와 혈관평활 근세포의 중식에 대한 영향을 항혈소판성 작용을 보이며 혈관세포들의 증식에 없어서는 안되는 spermine의 그것과 비교 검색하였다. Johnson 등(1985)의 방법에 따라서 제조한 aequorin부하-가토혈소판의 thrombin(0.25 units: TB)에 대한 응집반응에서, pyridazinone 유도체인 KR30075, sodium nitroprusside(SNP), imazodan, isobutylmethylxanthine(IBMX), rolipram, 및 spermine의 응집억제성 $IC_{50}$/ (M)은 각각 2.21 $\times$ $10^{-7}$, 1.26 $\times$ $10^{-6}$, 6.96 $\times$ $10^{-6}$, 7.78 $\times$ $10^{-6}$, 8.11 $\times$ $10^{-4}$, 및 4.28 $\times$ $10^{-3}$ M으로써 이들은 TB-응고반응에 동반되는 혈소판 [Ca$^{++}$]$_{i}$-증가에 대한 각각의 $IC_{50}$/과 차이를 보이지 않았으며, 유의한 상관성을 보였다.