• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권4호
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• pp.312-319
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• 2002

저온성 균인 Sporosarcina psychrophilia의 염색체 DNA를 추출하여 Sau3AI으로 부분 절단하고 pUC19 vector에 ligation 시킨 후, Escherichia coli pyrB mutant 균주에 형질전환하여 uracil이 없는 AB배지에서 생존하는 균주를 선택한 후, 그 plasmid를 분리하여 pSMI과 pSM2라고 명명하였다. 두 plasmid의 염기배열을 결정한 결과 pSM2 insert DNA는 pSMl insert DNA 부분을 포함하는 2,606 nucleotide 단편이었다. 염기서열을 분석하였을 때 이것은 1개의 완전한 open reading frame(ORF)과 2개의 부분 ORFs를 포함하고 있었다. 두 번째 위치한 완전한 ORF는 Bacillus caldolyticus aspartate transcarbamylase(pyrB)와 아미노산 서열 수준에서 59% 상동성을 보였고, 첫 번째와 세 번째 위치한 부분적 ORFs는 각각 Bacillus속의 uracil permease(pyrP)와 dihydoorotase(pyrC)와 높은 상동성을 보였다. 그리고 pyrB와 pyrP사이에 intergenic 부분에는 잠재적인 terminator, antiterminator, anti-antiterminator 구조를 포함하고 있었다. 이러한 결과는 S. psychrophilia pyrimidine 생합성에 관련된 유전자들은 다른 Bacillus속에서 알려진 바와 같이 유전자군을 형성하고 있을 것으로 추정했다. S. psychrophilia pyrB 유전자의 생성물을 과다발현 시키고 정제해서 그 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과 27 kDa 부근에서 band를 확인할 수 있었으며, 정제한 단백질도 ATCase 효소활성을 지니고 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권2호
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• pp.103-110
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• 2003

그람 양성세균에서 PyrR단백질에 의하여 피리미딘의 생합성이 조절된다는 발견을 바탕으로 하여, Synechocystis sp.PCC6803과 Haemophilus influenzae의 PyrR orthologue 유전자를 Bacillus subtilis에서 형질전환 시켜 피리미딘 생합성의 조절 유무를 조사하였다. Synechocystis sp.PCC6803과 H. influenzae의 PyrR orthologue유전자를 pUC19과 T-vector에 클로닝 한후 pKH1, pKH2, pHPSK1, pHPSK2으로 각각 명명하였다. 이것을 다시 Escherichia. coli와 B. subtiius용 shuttle vector인 pHPS9에 클로닝 하여 pKH3, pKH4, pHPSK3, pHPSK4로 각각 명명하였다. B. subtilis DB104Δ PyrR에 pKH3, pKH4, pHPSK3, pHPSK4을 형질전환후 ATCase 활성을 측정결과 pHPSK3을 가진 균주만 피리미딘에 의한 조절작용이 일어난다는 사실을 통하여, H. influenzae의 PyrR orthologue 유전자의 선도 부분에 조절에 관여하는 미지의 부분이 있음을 예측할 수 있었다. 서로 다른 유래의 PyrR orthologue단백질을 정제하기 위하여 pET14b에 클로닝후 pKH5, pHPSK5으로 각각 명명하였다. SDS-PAGE로 분석한 결과 각각 약 18 kDa과 21 kDa의 분자량을 나타내었다. 정제된 PyrR orthologue 단백질의 UPRTase 활성을 측정한 결과 H. infuenzae의 PyrR orthologue 단백질은 UPRTase 활성을 나타내었으며 다양한 pH에서 측정한 결과 pH 5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 반면에, Synechocystis sp. PCC6803의 PyrR orhologue 단백질은 UPRTase 활성을 나타내지 않았다. 여러 가지 균주의 PyrR 아미노산 서열을 비교한 계통수 분석은 PyrR 단백질의 조절기작과 어느 정도 연관됨을 시사해 주었다.

• KSBB Journal
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• 제9권4호
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• pp.372-377
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• 1994

L-Lysine 고역가 생산균주를 개발하기 위해 공지의 균주인 C. glutamicum KFCCI0672를 인공 돌연변이시켜 pyrimidine analouge인 6-azauraciI($4\ell$) 내성을 부여한 결과 모균주에 비해 L-Lysine 생산성이 3% 증가된 C. glutamicum CH0516을 획득할 수있었다. L-Lysine 생산성 향상의 원인을 규명하고자 C. glutamicum KFCCI0672 및 CH0516의 aspartoki­r nase(AKase)와 aspartate carbamoyltrasferase ( ATCase)의 aspartate에 대한 $K_m$값을 측정한 결 과 AKase의 $K_m$값은 200.0ruM, 166.7mM이었고 A TCase의 $K_m$값은 0.13ruM, O.27mM이었다. 한편 C. glutamicum KFCC10672와 CH0516의 AKase 비효소활성은 각각 $3.89{\times}1^{-1}$ Iunits/mg, $4.78{\times}10^{-1}$ lunits/mg이었고 A TCase의 경우는 각각 2.20units/mg, 1.84units/mg이었다. C C. glutamicum CH0516이 KFCCl0672에 비해 세포의 성장도가 낮고 L-Lysine 생산성이 높은 이 유로셔는 CH0516의 A TCase의 aspartate에 대한 K Km값이 KFCC10672의 값에 비해 크고 비효소활성 이 낮은 점에셔 찾을 수 있다. 즉 CH0516 A TCase 의 aspartate 사용량이 KFCC10672에 비해 낮기 때문에 여분의 aspartate가 AKase에 의해 L-Ly­s sme이 합성됩으로써 L-Lysine 생산성 증가가 얻어 진 것으로 사료된다. 이러한 사실은 CH0516 A AKase의 Km값이 KFCC10672에 비해 낮고 비효 소활성이 높은 점에셔도 뒷받침된다.